本发明专利技术提供了一种用于DNA?Marker制备的质粒及其构建方法与用途。本发明专利技术所述质粒含有组成目标DNA?Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA?Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA?Marker片段之间含有同样的单酶切位点。本发明专利技术还提供了低成本快速制备DNA分子量标准的方法，用该方法生产的DNA?Marker具有条带锐利，亮度均一或可随意控制，批次间重复性好等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与基因工程领域，涉及一种基因工程中得以广泛使用的 DNA分子量标准(DNA Marker)的生产方法。具体地，本专利技术涉及一种用于低成本快速生产高质量DNA Marker的质粒及其构建方法，同时涉及利用该质粒生产DNA Marker的方法与应用。
技术介绍
基因工程又称重组DNA技术，是指在体外在分子水平上对DNA进行切割、连接、修饰等一系列操作的过程，是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，诞生于20 世纪70年代的一门崭新的生物科学技术。尽管该技术是一门年轻的技术，但其在生命科学、生物医学领域甚至是物理学、高分子科学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。在对DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的分离、纯化、切割、修饰、连接、扩增、序列测定等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA的电泳。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在支持介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA电泳是基因工程中最基本的技术， DNA制备、检测、浓度测定、目的DNA片段的纯化，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的长度)呈线性关系。因此，可以用一组分子量(长度)已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量的DNA片段混合物就称为DNA分子量标准，简称DNA Marker。DNA Marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现 DNAMarker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前各实验室中DNA Marker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNA Marker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNAMarker产品。DNA Marker的制备上，目前主要有两种方法PCR法和酶切法。PCR法实现简单，通过PCR(聚合酶链式反应)技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、 定量和组合即形成了 DNA Marker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNAMarker。为了改善重复性和降低成本， 目前的主流方法已经由获得单一的DNA片度PCR向多重PCR(多对引物针对同一模板或一对引物针对多个面板的情况)技术发展。但其仍然存在成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差等缺点。酶切法又分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA 分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列DNA片段组合。用该方法生产的最经典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌体基因组DNA经过内切酶Hind III消化后，产生125bp至23130bp大小的8条条带。用这种方法生产DNA Marker 制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显然易见的1、条带距离不均勻，由于来自天然的基因组，DNA分子上的酶切位点的位置也是天然的，是不可控的， 因此DNAMarker中有的两个条带之间相聚很远，不能清晰地指示该区域内的未知DNA分子量情况，有的两个条带之间距离很近，难以清晰地分开；2、基于同样的原因，条带的分子量未能是整数；3、条带亮度严重不均一，这也是最严重的问题，由于对应片段在基因组中的拷贝数不可控，分子量大的条带的亮度与分子量较小的条带的亮度相差很远，以Lambda DNA/ Hind III Marker为例，最大的条带23130bp与最小的条带125bp在亮度上要相差上百倍， 电泳过程中往往导致大条带未实现良好分离而小条带已经严重扩散导致亮度很低甚至不可见。为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA Marker0通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，一旦质粒构建好，后续生产成本极低。酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性、温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法适用于以单位长度递增的DNA Marker (比如IOObp DNA Ladder，条带为lOObp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均勻，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA Marker质量较好，但其缺点是前期载体构建复杂，而且目前所报道的利用完全酶切的方法产生的DNA Marker均未完美地解决不同大小的DNA片段在质粒中的拷贝数的问题， 从而未能解决酶切后所得到的各条DNA分子之间亮度的均一性问题。综上所述，在目前DNA Marker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式虽然简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流，但目前仍然存在前期载体分子构建复杂，制备不同种类的Marker灵活性欠佳，后期制备过程中条带亮度不能完全均一的瓶颈。本专利技术通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，各条带的量完全一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一性，尤其是小条带的亮度问题。同时，本专利技术利用同尾酶的特点和巧妙的设计思路极大地简化此类DNA分子的构建过程，大大提高了 DNA Marker制备的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低成本DNA Marker生产和制备的方法。利用这种方法制备DNA Marker具有成本低、速度快，产物条带均一、锐利，条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示。本专利技术同时也提供了用于制备该DNA Marker的质粒及其构建方法。本专利技术根据准备生产的DNA Marke本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ制备的质粒，所述质粒含有组成目标ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ的各大小不同的ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ片段，各大小不同的ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ片段之间含有同样的单酶切位点。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李威，万军飞，
申请(专利权)人：生工生物工程上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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