本发明专利技术公开了一种多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质及其专用检测试剂盒。该蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列1，所述序列1的自氨基端第342位氨基酸残基为糖基化位点，该位点连接的糖链组成为[Hex]5[HexNAc]5[Fuc][NeuNAc]。该试剂盒，包括刀豆凝集素亲和层析试剂盒、SDS-PAGE电泳试剂盒、胰蛋白酶、蛋白酶K、糖肽富集分离试剂盒和质谱仪。可利用本发明专利技术的多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的糖基化位点和序列诊断多发性骨髓瘤。利用本发明专利技术的试剂盒，可以通过检测待测人血清/血浆中是否含有本发明专利技术的特异性糖基化蛋白质，快速辅助诊断多发性骨髓瘤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质及其专用检测试剂盒。
技术介绍
多发性骨髓瘤是血液系统常见的一种恶性肿瘤，表现为单克隆的浆细胞恶性增生。其发病率居血液恶性肿瘤发病率的第2位。多发性骨髓瘤起病缓慢、隐匿，早期临床表现不明显，容易被误诊。就诊时大部分已经是中晚期。因此需要研究有效、简单的早期诊断标志物及其诊断方法，以实现多发性骨髓瘤的早期发现(Oncologist，2007，12 :664 ； Journal of Clinical Oncology,2005, 23 :6345)。人血清/血浆中白蛋白是单链球形蛋白质，也是血清/血浆中含量最高的蛋白质， 通常情况下是非糖基化蛋白。其具有独特的结构和许多重要的生理功能。包括营养价值； 维持血液胶体渗透压；清除自由基；还可以结合和运输许多内源性与外源性物质，如血清 Ca2+、未结合胆红素、游离脂肪酸以及甲状腺激素等。人血清/血浆白蛋白本身还是许多内源性物质和外源性药物的载体，药物和白蛋白结合后，可以降低其生物利用度同时增加在体内的半衰期(Clin Perinatol，2004，31 :475 Journal of Infusion Nursing, 2006, 29 260)。白蛋白可以通过改变其氧化状态如糖基化、二硫键的增加来影响其蛋白构象，进而影响和药物的结合效率(British Journal of Pharmacology，2007，151 :580)。在多发性骨髓瘤的临床检查和诊断中，糖基化白蛋白水平同疾病进展有很大关系，是一个重要的预后指标。人血清/血浆白蛋白三维结构包括三个结构上相似的功能域1 (1-195)、 11(196-383)和III (384-585)，每个结构域又分为两个相似的螺旋结构的亚结构域。亚结构域 ΙΑ-IB、IIA-IIB、IIIA-IIIB 间的连接，则分别是 ltl6K 至119E、292E 至 ”5V、492E 至 511A 的三段伸展肽链，每个结构域具有不同的结合特性。目前公认在IIA和IIIA存在两个芳香族或杂环类物质的结合位点，在IB和IIIB存在长链脂肪酸的结合位点(Journal of Biological Chemistry, 1999,274 :29303 ；Protein Engineering, 1999，12 :439)。绝大部分药物都与白蛋白的亚结构域IIA结合，在此亚结构区域中存在一个可以与许多药物结合的较大的疏水区，其它亚域也可能对其结合产生影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质及其专用检测试剂品.ο本专利技术所提供的多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质，其氨基酸序列为序列表中序列1，所述序列1的氨基端第342位氨基酸残基为糖基化位点，该位点连接的糖链组成为 55 。上述多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质糖基化位点为mM(N为天冬酰胺)，属于 N-连接的复杂型糖链，糖链组成为 55 。其中，Hex表示己糖，HexNAc表示N-乙酰氨基己糖，Fuc表示岩藻糖，NeuNAc表示唾液酸。342N糖基化位点位于 IIB，与健康人血清白蛋白的差异为自氨基端第344位丙氨酸(344A)突变为苏氨酸(344T),该位点的突变所引起的糖基化可能与多发性骨髓瘤的发生有关。本专利技术所提供的检测多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的试剂盒，包括刀豆凝集素亲和层析试剂盒、SDS-PAGE电泳试剂盒、胰蛋白酶、蛋白酶K、糖肽富集分离试剂盒和质谱仪。所述糖肽富集分离试剂盒包括以质量比为1 1的石墨碳和活性炭的混合物为填料的层析柱。所述石墨碳的颗粒直径范围为5-8 μ m,活性炭颗粒直径范围为3-5 μ m。所述刀豆凝集素亲和层析试剂盒包括刀豆凝集素亲和层析柱、结合缓冲液和洗脱缓冲液；所述结合缓冲液为由20mM Tris-HCl，0. 15M NaCl,lmM MnCl2, ImM CaCl2和水组成， pH7. 4的溶液；所述洗脱缓冲液为pH7. 4,0. 5M甲基- α -D-吡喃葡萄糖苷的水溶液。所述糖肽富集分离试剂盒还包括上样缓冲液、平衡液和洗脱液；所述上样缓冲液和平衡液均为ρΗ3. 0，体积百分浓度为0. 2%的甲酸溶液；所述洗脱液为含有体积百分浓度为0. 2%的甲酸的体积百分浓度为30%的乙腈溶液。本专利技术还提供一种检测多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的方法，包括下述步骤1)用刀豆凝集素亲和层析的方法富集疑似多发性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，以健康人血清为对照；2) 10% SDS-PAGE电泳分离1)中得到多发性骨髓瘤患者血清中的糖蛋白，切下含有66kDa处与健康人血清中有差异的蛋白条带的凝胶；3)将含有多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的凝胶，进行胰酶胶内酶切，之后加入蛋白酶K酶切，获得双酶切溶液；4)用层析分离方法富集步骤3)中获得的双酶切溶液中的糖肽；所述层析分离方法所用的层析柱的填料为质量比为11的石墨碳和活性炭的混合物；5)利用基质辅助激光解吸电离质谱测定糖肽，获得糖基化位点和糖链的信息；若获得的蛋白的序列如序列1所示，并且自氨基端第342位氨基酸为糖基化位点，则该蛋白为多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质。可利用本专利技术的多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的糖基化位点和其序列(与健康人血清白蛋白的差异为自氨基端第344位丙氨酸(344A)突变为苏氨酸(344T))确诊多发性骨髓瘤患者。利用本专利技术的试剂盒，可以通过检测待测人血清/血浆中是否含有本专利技术的特异性糖基化蛋白质实现对多发性骨髓瘤的快速诊断。附图说明图1为刀豆凝集素富集后健康人(NE)和三例多发性骨髓瘤患者(M1E、M2E和M3E) 血清中糖蛋白质的电泳图。图2为刀豆凝集素富集后多发性骨髓瘤患者(MlE)、肺癌患者(LIE和L2E)和胰腺癌患者(PlE和P2E)的血清糖蛋白的电泳图。图3为多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。图4为多发性骨髓瘤患者中特异性糖基化蛋白质的糖肽质谱图。图5为多发性骨髓瘤患者中特异性糖基化蛋白质的糖肽结构鉴定质谱图。具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的发现和结构鉴定一、刀豆凝集素亲和层析对血清中糖蛋白的富集和分离方法及其效果鉴定1、刀豆凝集素亲和层析柱的制备及层析富集方法刀豆凝集素亲和层析柱购自Vector公司。利用刀豆凝集素亲和层析柱进行亲和层析富集糖蛋白的方法如下所述1)平衡用 10 倍体积的结合缓冲液(由 20mM Tris_HCl，0. 15M NaCl，ImM MnCl2, ImM CaCl2和水组成，pH7. 4的溶液)平衡刀豆凝集素亲和层析柱；2)上样200 μ L血清与1. 8mL结和缓冲液及苯甲基磺酰氟(lmM/mL)混合，4°C混勻过夜，然后过步骤1)平衡后的刀豆凝集素亲和层析柱；3)冲洗用10倍体积的结合缓冲液洗去未结合的非糖蛋白；4)洗脱用5倍体积的洗脱缓冲液(pH7. 4，0. 5M甲基-α -D-吡喃葡萄糖苷的水溶液)洗脱糖蛋白。2、刀豆凝集素亲和层析对血清中糖蛋白的富集和分离的效果鉴定本专利技术的专利技术人通过实验，鉴定了刀豆凝集素亲和层析对多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多发性骨髓瘤特异性糖基化蛋白质，其氨基酸序列为表中序列１，所述序列１的氨基端第３４２位氨基酸残基为糖基化位点，该位点连接的糖链组成为［Ｈｅｘ］５［ＨｅｘＮＡｃ］５［Ｆｕｃ］［ＮｅｕＮＡｃ］，其中，Ｈｅｘ表示己糖，ＨｅｘＮＡｃ表示Ｎ－乙酰氨基己糖，Ｆｕｃ表示岩藻糖，ＮｅｕＮＡｃ表示唾液酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李智立，张海婧，刘辉，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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