快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒，包括如下步骤：1）基因组DNA模板的制备；2）PCR扩增反应：通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3）PCR产物检测：凝胶电泳检测PCR产物；4）限制性内切酶消化反应：用DdeⅠ内切酶对PCR产物进行酶切；5）酶切产物检测：凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。本发明专利技术的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒。
技术介绍
目前国际上公认的李斯特菌共有6种单核细胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，简称单增李斯特菌)、绵羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西尔李斯特菌(listeria seeligcri).其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ！的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一； 绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；近期有国内外报道，英诺克李斯特菌存在于食品中，当其发生由非溶血性变为溶血性的变异时， 对人类具有一定的潜在致病性；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。 目前，人们对这几种李斯特菌的分布状况不甚明了，为了能调查清楚不同李斯特菌的分布环境，首先需要发展适宜的检测鉴定几种李斯特菌的方法。掌握食品被李斯特菌污染状况是获得安全食品的重要一步，也是防止食物中毒， 保障人民健康的最有效的一步。按传统的生化鉴定方法检测鉴定李斯特菌时，有时会造成漏检，国内外已有多次非典型菌株缺少典型特征的报道；同时通过传统生化鉴定方法不易于做6种李斯特菌的种间区分。鉴于此，通过分子生物学方法鉴定李斯特菌得到了广泛的发展，然而目前这些方法主要是做李斯特菌属的鉴定。PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism)方法常被用来做鉴定物种的方法。，该方法将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。该方法操作简单，结果容易判定。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供了一种检测和鉴别单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒。本专利技术的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。为达到上述的目的，本专利技术采用如下技术方案，一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法，包括如下步骤1)基因组DNA模板的制备；2)PCR扩增反应通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3)PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4)限制性内切酶消化反应用DdeI内切酶对PCR产物进行酶切；5)酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。所述的步骤5)中比对方法为当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。所述步骤2)中PCR扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为 上游引物 5’ -ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3，；下游引物 5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述步骤2)中PCR扩增反应的反应液组成如下10 X扩增缓冲液5 μ L ；(购于FERMENTAS公司) 4种dNTP混合物各200 ymol/L;(购于生工生物工程(上海)有限公司) 引物对各0.5 μ mol/L ；DNA模板2 yg;Taq DNA聚合酶2 u;(购于生工生物工程(上海)有限公司) MgCl2 1. 5 mmol/L ； 加ddH20至50 μ L0所述PCR扩增反应条件如下95 °C变性3 min ；95 °C变性15 S,58 °C变性30 S、 72 °C变性45 S，进行35个循环扩增；72 °C延伸5 min。所述步骤4)中限制性内切酶消化反应体系按20 μ L计如下所示DNA (PCR扩增后的产物)0.2-1 μ g ； IOX酶切buffer 2.0 μ L ；(购于天根生化科技(北京)有限公司)限制性内切酶Dde I 1-2 u ；(购于天根生化科技(北京)有限公司) 力口 ddH20 M 20 μ L。所述限制性内切酶Dde I消化反应的反应条件如下按上述配比先加入DNA (PCR 扩增后的产物)，10X酶切buffer，加ddH20至20 μ 1，最后加入限制性内切酶Dde I，轻轻混勻，稍加离心，放置于水浴温育。所述水浴温度为37°C，温育时间为lh。一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法所用的试剂盒，包括如下组成李斯特菌iap基因特异引物对，限制性内切酶Dde I，酶切标准图谱(见图3)和阳性对照液(iap 基因标准品)iap基因标准品序列见GenBank。试剂盒中其它组成，可按本领域常规进行选择。试剂盒实施步骤按上述的快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法的步骤进行。本专利技术的有益效果是本专利技术建立了检测和鉴定5种李斯特菌的PCR-RFLP方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR 扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用RFLP技术，一次即可对5 种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述本专利技术的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。附图说明图1为本专利技术具体实施例1中标准菌珠的PCR扩增产物电泳M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；图2为本专利技术具体实施例1中标准菌珠的PCR-RFLP产物电泳图； M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；图3为酶切标准图谱；M、Marker，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌。具体实施例方式实施例1本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种快速检测鉴定李斯特菌的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，其特征在于：包括如下步骤：１）基因组ＤＮＡ模板的制备；２）ＰＣＲ扩增反应：通过李斯特菌ｉａｐ基因特异引物对，进行ＰＣＲ扩增反应；３）ＰＣＲ产物检测：凝胶电泳检测ＰＣＲ产物；４）限制性内切酶消化反应：用ＤｄｅⅠ内切酶对ＰＣＲ产物进行酶切；５）酶切产物检测：凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈信忠，郭书林，龚艳清，林立，陈垚，杨俊萍，孔繁德，徐淑菲，叶妍妍，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：92