本发明专利技术以提供排除诊断上的假阳性的新颖的结核菌检测用引物和探针，以及提供使用它们简便、迅速并且高灵敏度地检测人型结核菌的方法为课题，涉及含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸；含有所述寡核苷酸的人型结核菌检测用引物和探针；以及以使用该引物和探针为特征的人型结核菌的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测人型结核菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，以下称为人型结核菌)的检测方法。
技术介绍
人型结核菌是导致人产生结核病的病原体，是被分类在分枝杆菌属 (Mycobacterium)并具有抗酸性质的革兰氏阳性杆菌。结核病虽然近年显著减少，但是，最近产生了老年人的发病率上升、在没有经历过结核感染的年轻人中引起集体感染等重大问题。另一方面，除了人型结核菌以外，已知鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内 ^felflii (Mycobacterium intracellulare)lif (Mycobacterium kansasii) 等非结核性抗酸菌对人表现病原性。另外，在感染AIDS病毒的免疫缺陷者当中，非结核性抗酸菌引起疾病成了主要问题。由于这些非结核性抗酸菌病多数对抗结核药具有抗药性， 所以在决定治疗方案时，鉴别诊断结核病和非结核性抗酸菌病是很重要的。但是，从临床症状、病理组织学的观点来看，鉴别结核病是非常困难的，因此诊断必须通过菌的鉴定来进行。在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时，一般通过小川培养基分离培养样品， 为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。然而，通常由于分枝杆菌属生长慢，培养时需要相当长的时间。因此，进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时，为了得到结核病与否的诊断结果，光是菌的分离培养就需要3 4周时间，然后在鉴定种的各种试验中还需要2 3周时间。另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法，但是，由于分枝杆菌属种之间的交叉反应，欠缺相对于结核菌的特异性，灵敏度也不够。近年，利用聚合酶链反应(PCR)等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被研究，也研究了可以被利用到结核菌的诊断中，研究了结核菌DNA基因组的各区域是否在用PCR进行的结核菌检测中可以用作靶标。例如报道了检测编码分枝杆菌属的65千道尔顿抗原的基因区域的方法(例如参照非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4、非专利文献幻。然而，已知 65千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外，在鸟分枝杆菌(M. avium)(鸟型结核菌)、偶发分枝杆菌(M. fortuitum)、副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、BCG和海分枝杆菌(M. marinum)等同属菌中也具有。尤其是，由于与非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高，因此检测65 千道尔顿抗原基因的方法作为特异地检测人型结核菌的方法还存在问题。另外，研究了使用自牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)DNA鉴定的序列-编码 MPB70蛋白质的基因序列进行结核分枝杆菌的鉴定的试验方法(例如，参照非专利文献6)。 然而，Kulski 等人在 FEMS Microbiol Lett. 1997 年 3 月 1 日；148(1) :43-48(非专利文献 7)报道了其结果，已知其中进行的PCR检验结果在以MPB70蛋白质作为靶标时，与堪萨斯分枝杆菌的DNA中存在的类似序列产生交叉反应，该方法在特异地检测人型结核菌检测中也存在问题。此外，报道了编码蛋白质抗原b (Pab)的基因序列作为标记的结核分枝杆菌/牛分枝杆菌的检测方法(例如参照非专利文献8)，证实了以结核分枝杆菌/牛分枝杆菌检测目的使用该标记的有效性。但是，由于考虑到Pab基因在结核基因组中仅存在一个拷贝，因此不太优选作为核酸扩增的靶标材料(相对地，后述的IS6110序列在核酸基因组中存在10 个拷贝。)。此外，报道了 IS6110作为探针的RFLP (限制性片段长度多态性)可以在结核菌的诊断中使用(例如参照非专利文献9)，并且可以作为结核的流行病学调查的重要工具在世界各国中被使用。IS6110是结核菌特有的插入序列，在染色体DNA中存在多个IS6110，其在每种菌株中的数目、位置不同，其特性在一定程度上稳定地遗传下去。其结果是根据菌株的不同而显示不同的RFLP型，也可以分为衍生的组。直至目前为止，很多报道涉及使用 IS6110的结核检测方法，报道了具有超过75%的灵敏度和接近100%的特异性。但是，另一方面，研究结果也报道了在使用IS6110的检测方法中，存在产生假阳性的问题(非专利文献10)。另外，也有对IS6110设计特异的引物而进行PCR的检测方法(例如参照专利文献 1、专利文献2、专利文献3、专利文献4)，但存在涉及结核分枝杆菌以外的来自分枝杆菌属的与IS6110相关的序列也扩增的问题。另外，IS6110样序列也存在于结核菌以外的其他微生物中，在以IS6110作为靶标的检测方法中，暗示了这些微生物也被检测出来的问题。因此，历来检测IS6110的方法在特异地检测各种人型结核菌方面是不充分的，并存在问题。由以上看出目前的情况是期望确立一种新的特异地检测人型结核菌的方法。专利文献1 特表平5-507617号公报专利文献2 特表平11-514522号公报专利文献3 日本专利第观14422号公报专利文献4 美国专利第5370998号说明书专利文献5 特开昭60-500717号公报专利文献6 特开昭60-281号公报专利文献7 美国专利第5210015号说明书专利文献8 美国专利第5538848号说明书专利文献9 美国专利第5，801，155号说明书专利文献10 美国专利第5925517号说明书专利文献11 美国专利第6，492，121号说明书专利文献12 日本专利第沈50159号公报专利文献13 特公平7-114718号公报专利文献14 特开昭58-40099号公报专利文献15 特开昭62-265999号公报非专利文献1 :Chia等人，J. Clin. Microbiol.，1990年，第观卷，第9期， 1877-1880 页；非专利文献2 =Brisson-Noel 等人，Lancet, 1989 年，第 3；34 卷，p. 1069-1071非专利文献3 :Hackel 等人，Molecular and cellular Probes，1990 年，第 4 卷， p. 205-210非专利文献4 :ffoods, Cole, FEMS Mycrobiology Letters, 1989 年，第 65 卷， p. 305-310非专利文献5 =Hance 等人，Molecular Microbiology, 1989 年，第 3 卷，第 7 期， p.843-849非专利文献6 :Kulski 等人，J. Clin Microbiol.，1995 年，第 33 期，p. 668-674非专利文献7 =Kulski 等人，FEMS Microbiol Lett. 1997 年 3 月 1 日，第 148 卷， 第 1 期，p. 43-48非专利文献8 =Sjobring 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第沘卷，第 10 期， P. 2200-2204非专利文献9 =Hermans PWM 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．由以下组成的人型结核菌检测用引物对：（ｉ）由序列号２所述的核酸序列或者其互补序列组成的，并且与人型结核菌的ＩＳ６１１０基因的核酸序列杂交的引物；和（ｉｉ）由序列号４所述的核酸序列或者其互补序列组成的，并且与人型结核菌的ＩＳ６１１０基因的核酸序列杂交的引物。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：石川友一，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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