本发明专利技术公开了一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置，该方法使用径向偏振光和切向偏振光分别作为荧光激发光束和荧光抑制光束，依次通过显微物镜的聚焦和介质微球的纳米喷射后，再作用于荧光样品并激发荧光信号，通过对荧光信号的收集和分析处理完成荧光相关谱分析。该装置依次包括：产生径向偏振光和切向偏振光的光源、第一显微物镜、介质微球、放置有荧光样品的样品架和第二显微物镜，还包括与第二显微物镜连接的荧光信号分析处理装置。第一显微物镜、介质微球、荧光样品和第二显微物镜均处于径向偏振光和切向偏振光的同轴光路上，且介质微球位于第一显微物镜的物方焦平面上。本发明专利技术可以有效应用于高浓度荧光分子样品中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学计量及超分辨成像领域，具体涉及一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置。
技术介绍
科学技术的发展使得人们极大地扩展了自己的视野。随着研究的深入，人们对于微观领域产生了越来越浓厚的兴趣。在化学、生物、医学等诸多领域，为了可以更加准确地掌握研究对象的性质，对单分子的探测与分析成为一种必不可少的研究手段。为了满足上述要求，相应的仪器设备被大量开发出来，荧光相关谱分析装置(Fluorescence Correlation Spectroscopy,FCS)正是其中之一。通过动态地记录收集到的荧光信号的强弱，并进行自(互)相关数字信号处理，FCS可以有效地对活体细胞内的生化反应速率、分子流动速度和分子扩散等信息进行实时测量，从而成为生物化学研究中使用最为广泛的分析装置之一。然而，作为一种光学共焦成像系统，FCS的分辨能力也不可避免地受到了光学远场衍射极限的限制。因此当测试样品中荧光分子浓度过大时，往往不能有效地进行单分子测量而对最终的测试结果产生干扰。解决这个问题最直接的办法是对测试样品进行稀释，然而，鉴于许多的生化反应必须在高浓度浸润环境下才可以完成，采用稀释的办法得到的测试数据并不可靠，甚至可能由于反应无法进行而造成测试失败的结果。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置，使用径向偏振光和切向偏振光分别作为荧光激发光束和荧光抑制光束，通过介质微球的纳米喷射，突破光学远场衍射极限的限制，提高分辨率，并且有效减小了荧光相关谱分析装置(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)中的有效激发面积，可以有效应用于高浓度荧光分子样品中。一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法，包括以下步骤(1)使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，将所述的荧光激发光束和荧光抑制光束同轴平行入射到显微物镜中，并被所述的显微物镜同时聚焦在介质微球上；所述的介质微球位于所述的显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为1 10um，折射率为1. 4 2 ；(2)所述的介质微球对经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束和荧光抑制光束进行再次聚焦，在所述的介质微球下表面产生纳米喷射(Nanojet)；所述的纳米喷射 (Nanojet)包括由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束产生的纳米喷射和由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光抑制光束产生的纳米喷射，其中，由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束产生的纳米喷射为实心亮斑，由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光抑制光束产生的纳米喷射为中空的暗斑；(3)将步骤(2)所产生的纳米喷射作用于荧光样品并激发荧光信号；换言之，由所述的荧光激发光束产生的纳米喷射和荧光抑制光束产生的纳米喷射共同作用于荧光样品并激发荧光信号；(4)收集步骤( 所激发的荧光信号并进行分析处理，得到荧光相关谱。其中，步骤⑴所述的径向偏振光和切向偏振光，可以是作为工作光束直接入射； 也可以由激光器发出的工作光束转换而来，所述的转换可以通过偏振转换器实现，也可以通过现有技术中其他方法实现。其中，步骤(1)所述的显微物镜，优选为大数值孔径显微物镜，可以为非浸没式或浸没式，其中非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. 0 1. 4，放大倍率为80 100倍。其中，步骤(4)中可以通过显微物镜来收集步骤(3)所激发的荧光信号，也可以通过现有技术中其他方法实现。当通过显微物镜收集所述的荧光信号时，该显微物镜可以是与步骤(1)所述的显微物镜为同一显微物镜，此时收集反射回来的荧光信号，构成“反射模式”；也可以是与步骤(1)所述的显微物镜的参数完全相同并在位置上构成共焦关系的显微物镜，此时收集透射回来的荧光信号，构成“透射模式”。其中，步骤中对于收集到的荧光信号进行分析处理采用现有技术中通用方式来实现，通常是采用计算机来进行分析处理。本专利技术还提供了用于实现上述的基于介质微球的荧光相关谱分析方法的装置，依次包括光源、第一显微物镜、介质微球、样品架和第二显微物镜，还包括与第二显微物镜连接的荧光信号分析处理装置；其中，所述的光源，用于产生平行入射的同轴的径向偏振光和切向偏振光；所述的第一显微物镜，用于对所述的径向偏振光和切向偏振光进行聚焦；所述的介质微球，用于对经第一显微物镜聚焦后的径向偏振光和切向偏振光进行再次聚焦，产生纳米喷射；所述的样品架，用于放置待观察的荧光样品，所述的荧光样品在所述的纳米喷射的作用下激发产生荧光信号；所述的第二显微物镜，用于收集所述的荧光信号；所述的荧光信号分析处理装置， 用于分析和处理所收集到的荧光信号；所述的第一显微物镜、介质微球、放置在样品架上的待观察的荧光样品和第二显微物镜均位于所述的径向偏振光和切向偏振光的同轴光路上，所述的介质微球位于所述的第一显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为1 10um，折射率为1. 4 2。其中，所述的光源，可以为直接发出径向偏振光和切向偏振光的光源；也可以为激光光源和偏振转换器的组合，即，由激光光源发出线偏光并经偏振转换器转换得到径向偏振光和切向偏振光。所述的偏振转换器可以为现有技术中实现圆柱形偏振光的转换的任何器件与装置，优选为瑞典ARCoptix公司的偏振转换器feidial-Azimuthal Polarization Converter。其中，所述的第一显微物镜和第二显微物镜，优选为大数值孔径显微物镜，可以为非浸没式或浸没式，其中非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. 0 1. 4，放大倍率为80 100倍。所述的第二显微物镜可以与所述的第一显微物镜为同一显微物镜，此时收集反射回来的荧光信号，构成“反射模式”；所述的第二显微物镜也可以与所述的第一显微物镜的参数完全相同，并在位置上构成共焦关系，此时收集透射回来的荧光信号，构成“透射模式”。所述的荧光信号分析处理装置，通常为计算机。本专利技术的工作原理如下使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，两光束同轴平行入射到大数值孔径显微物镜中。两光束通过大数值孔径显微物镜后，在大数值孔径显微物镜的物方焦点附近产生聚焦光场。由于介质微球位于大数值孔径显微物镜的物方焦点上，因此荧光激发光束和荧光抑制光束将通过介质微球的再次聚焦作用，在介质微球下表面产生纳米喷射现象，由于两光束偏振状态不一致，荧光激发光束产生的纳米喷射为实心亮斑，荧光抑制光束产生的纳米喷射为中空的暗斑。由于介质微球的场限制效应，两种纳米喷射的尺寸在径向和轴向上都将小于一般的光学远场衍射极限。同时，根据STED原理，FCS 系统的有效激发面积将在径向上被进一步限制，这种限制效应随着荧光抑制光束光强的增加而不断加强。有效激发面积的减小使得在同一时刻，只有来自单分子的荧光可能被FCS 系统观察到，从而使高浓度荧光分子样品的单分子观察成为可能，提高了观察的准确性。位于有效激发面积内的分子将被激发产生荧光信号，进一步通过大数值孔径显微物镜进行收集并分析处理，得到荧光相关谱。相比于现有技术，本专利技术具有以下有益的技术效果(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，将所述的荧光激发光束和荧光抑制光束同轴平行入射到显微物镜中，并被所述的显微物镜同时聚焦在介质微球上；所述的介质微球位于所述的显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为１～１０ｕｍ，折射率为１．４～２；（２）所述的介质微球对经步骤（１）中显微物镜聚焦后的荧光激发光束和荧光抑制光束进行再次聚焦，在所述的介质微球下表面产生纳米喷射；（３）将步骤（２）所产生的纳米喷射作用于荧光样品并激发荧光信号；（４）收集步骤（３）所激发的荧光信号并进行分析处理，得到荧光相关谱。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，郝翔，刘旭，王婷婷，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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