一种用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法技术

本发明专利技术涉及生物基因工程领域，提供了一种用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法。所述方法包括以下步骤：A.制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系；B.制备包含多种油脂混合在内的油相体系；C.将水相体系与油相体系混合，制备乳浊液体系。本发明专利技术中利用水、油两相的混合比例以及制备的振荡频率和时间对乳浊液体系进行控制，使得乳浊液体系中包含有更多的液滴数量，同时在保证乳浊液稳定的前提下，增大其所含有的液滴体积，进而使其能够用于扩增更长的片段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，更具体地说，涉及一种用于扩增长片段的乳浊液体系的制备方法。
技术介绍
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)作为分子生物学里程碑式的技术，已经广泛应用于各个学科。与此同时，由于新的目的与要求，这项传统的技术也在日新月异的发展之中。在高通量测序
，已经出现乳液PCR(emulsion PCR, ePCR)技术，通过各自独立的油包水液滴反应空间，能够在大规模扩增基因的同时，保持扩增产物的各自分离，而进行ePCR反应的关键在于乳浊液体系的制备。随着高通量测序中对通量的要求越来越高， 对测序片段的长度也要求越来越高。目前乳浊液体系的制备出现由于液滴数量较少、体积过小而制约扩增片段的扩增长度的问题，这严重限制高通量测序技术的发展。针对上述缺陷，急需一种能够用于扩增长片段且含有更多液滴数量的乳浊液体系制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于扩增长片段并且含有更多液滴数量的乳浊液体系制备的技术方法，旨在解决乳浊液体系中扩增长度短、液滴数量少和/或体积小的问题。为实现本专利技术的目的，所述用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法步骤如下所示A.制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系；B.制备包含多种油脂混合在内的油相体系；C.将水相与油相体系混合，制备乳浊液体系；其中，步骤A和步骤B无先后顺序。其中，步骤A中包括Al.将目的扩增片段对应的引物连接到固相载体，得到带引物的固相载体；A2.将其他扩增体系试剂与带引物的固相载体混合，制备水相体系。其中，上述固相载体可以选用微珠或者磁球，其表面可以采用聚丙烯酰胺修饰、醛基修饰或链霉亲和素修饰；相应的，结合的引物则采用丙烯酰胺修饰、氨基修饰或生物素修饰。其中，上述水相体系，包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体，包含扩增反应所必需的其他试剂，同时还加入能加快扩增反应启动的一对小引物。其中，上述步骤B中选择用于制备油相体系的各种油脂在热稳定性以及密度上具有一定的要求，它们按照一定比例混合之后要使得形成的油相体系的热稳定性可以保证制备出来的乳浊液体系在反应过程中不会破裂，而且它们的混合密度要能使之后放入的辅助微固体材料如钢珠等可以在其中自由移动，具体的油相组成将会在实施例中给出。其中，所述步骤C包括Cl.将水相加入到油相体系中混合，得到水油混合体系；C2.水油混合体系中加入辅助微固体，得到乳浊液混合物；C3.将乳浊液混合物放置于乳浊液制备仪上，振荡打勻形成乳浊液体系。其中，上述步骤Cl中水、油两相的混合顺序可以调整，采取不同的方式。其中，上述步骤C2中辅助微固体可以采用钢珠、玻璃珠或塑料珠的至少一种。其中，上述步骤C3中利用乳浊液制备仪制备乳浊液的条件根据待测模板长度和固相载体的大小变化，可以选择不同的振荡频率。其中，上述步骤C之后还可包括步骤D.利用制备的乳浊液体系进行ePCR扩增反应。其中，根据连接在固相表面的引物的不同，可以进行不同的PCR扩增反应若只固定了一条引物，则可以进行单引物扩增反应；若分别固定了上、下游两端引物，则可以进行双引物扩增反应，由此可以进一步延长扩增片段的长度。由上可知，本专利技术通过控制水油两相体系的混合比例以及制备时的振荡频率和时间，对乳浊液的制备进行控制，使其能够得到更多的液滴数量，同时在保证稳定的前提下， 增大液滴的体积，使其能够应用于更长片段的扩增反应体系中。附图说明图1是本专利技术一个实施例中用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法流程图。图2是本专利技术实施例中制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系的方法流程图。图3是本专利技术实施例中水油两相混合制备乳浊液体系的方法流程图。图4是本专利技术一个实施例中基于制备好的扩增长片段的乳浊液体系进行桥式 ePCR扩增反应的方法流程图。图5是本专利技术一个实施例中基于制备好的扩增长片段的乳浊液体系进行桥式 ePCR扩增反应的示意图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。图1是本专利技术一个实施例中用于扩增长片段的乳浊液体系制备的方法流程图。该方法包括步骤SlOl中，制备包含连有目的扩增片段对应引物的微珠在内的PCR mix水相体系。本步骤将在后续图示中做详细阐述，在此不再赘述。步骤S102中，制备包含多种油脂混合在内的油相体系。制备油相体系的过程中， 对于油脂的要求是热稳定性好、密度低。其中，步骤SlOl与S102的顺序可以互换，也可以同时进行。步骤S103中，将水相与油相体系混合，制备乳浊液体系。辅助微固体材料优选钢珠，水相体系注入到油相体系，放置于乳浊液制备仪上振荡混勻。图2示出了步骤SlOl制备包含连有目的扩增片段对应引物的微珠在内的PCR mix 水相体系的方法流程。其中包括步骤SlOll中，首先对微珠表面和引物分别进行相应的修饰，修饰后的微珠与引物结合得到带引物的微珠。微珠表面可以采用聚丙烯酰胺修饰、醛基修饰或链霉亲和素修饰；相应的，所要结合的引物可以进行丙烯酰胺修饰、氨基修饰或生物素修饰。本实施例中选择采用链霉亲和素以及相应的生物素进行修饰。将经链霉亲和素修饰的微珠与生物素修饰的引物放入连接缓冲液(binding buffer)混合均勻，放置于旋转仪上，孵育Ih即可使二者通过链霉亲和作用结合。在步骤S1012中，将步骤SlOll中得到带引物的微珠与其他扩增试剂混合，制备水相体系。制备的水相体系如下(1) 10XPCR buffer, 15 μ L ； (2)dNTP，3 μ L ； (3) DNA模板， 2 μ L ； (4)引物结合后的微珠，5 μ L ； (5) Taq 酶，9 μ L ； (6) Mg2+，3 μ L ； (7) ddH20,114 μ L ； (8) 在水相体系中优选加入能够加速反应启动速度的一对小引物，上、下游两端各0. 75 μ L0图3示出了本专利技术一个实施例中将水相与油相体系混合制备乳浊液体系的方法流程。其中包括步骤S1031中，水相体系与油相体系进行混合得到水、油混合体系。两者混合的顺序一般为水相注入到油相中，然后混合。但也可按照由少注入多的原则，两者混合顺序可以调换。本实施例中优选水相注入到油相中，两者混合的比例为水相150 μ L，油相600 μ L0步骤S1032中，水、油混合体系中加入辅助微固体材料，得到乳浊液混合物。水、油两相混合之后，往其中加入辅助微固体材料。加入的辅助微固体材料，必须与之前建立的水、油混合体系相匹配，能够悬浮于其中。根据实验条件的不同，可以选择加入钢珠、玻璃珠或塑料珠等。本实施例中优选加入钢珠。步骤S1033中，将上述乳浊液混合物振荡打勻形成乳浊液体系。乳浊液制备仪的振荡条件直接关系到乳浊液体系中液滴的多少及其体积的大小，因此需要合适的振荡条件实现本专利技术的目的。本专利技术根据待测模板长度和固相载体的大小变化，可以选择不同的振荡频率。其中，本实施例中制备乳浊液体系的条件为乳浊液制备仪的振荡频率13ΗΖ，时间为 13s。图4是本专利技术一个实施例中基于用于扩增长片段的乳浊液体系进行片段扩增的方法，该实施例是在一个具体的应用场景中，基于乳浊液体系进行桥式ePCR扩增的过程。步骤S201中，制备包本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于扩增长片段的乳浊液体系制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：Ａ．制备包含连有目的扩增片段对应引物的固相载体的水相体系；Ｂ．制备包含多种油脂混合在内的油相体系；Ｃ．将水相与油相体系混合，制备乳浊液体系；其中，步骤Ａ和步骤Ｂ无先后顺序。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，
申请(专利权)人：盛司潼，
类型：发明
国别省市：94