本发明专利技术涉及一种快速制备扩增模板的方法，本发明专利技术的技术方案是：将3毫米×3毫米鱼的鳍条与100微升TE buffer置于1.5毫升离心管中，离心、于-20℃冷冻30min、水浴加热、离心分离、取上清液。本发明专利技术的方法优点在于：1、取样量少，只需3毫米×3毫米的组织样品，对受试材料几乎没有伤害，完全可以满足受试材料活体分析的需要；2、简单、切实可行，只需将样品于PCR板中冷冻、融化、离心、吸上清，可使用96孔PCR板进行批量制备；3、快速高效，整个制备过程只需40分钟，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作步骤，不需要使用昂贵的仪器；4、避免了传统方法中氯仿、异戊醇等对人体有害的化学试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，是一种快速制备PCR扩增模板的方法。
技术介绍
随着生物技术的飞速发展，以DNA为基础的研宄已经成为生物技术的核心，能够 快速提取出基因组DNA是进行PCR检测、构建DNA文库及其他许多分子生物学研宄操作的 的基本如提。 传统的DNA提取步骤主要分为：破坏细胞膜（植物等还有细胞壁）、除蛋白、沉淀 DNA、除杂和溶解。最为经典的DNA提取方法是酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法， 此外有很多方法是在这些基础上进行改进的。这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸 钠（SDS)消化破碎细胞，在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或 异丙醇沉淀DNA;甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析 来处理DNA样品。此外，目前应有较多的还有CTAB法、SDS法、高盐法、试剂盒法等。 上述这些方法虽能提取出较高纯度的DNA，但操作繁琐、耗时长、且所用试剂（如 苯酚、异丙醇等）具有一定的毒性，会对环境造成污染；试剂盒虽能较快提取高质量的DNA， 但成本较高，不适合大规模应用。而在进行数量遗传学相关研宄及动植物育种时，常常需要 较大的样本量及批量提取DNA，以上所述的DNA提取方法已不能很好地满足这一要求。中 国专利文献CN200810071267. 4,公告日2008年10月29日公开了一种大批量快速制备PCR 模板的方法，其方法是：将微量植物叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解，然后中和，反 应混合液可直接作为PCR反应的模板，能够快速大批量的制备PCR反应模板。但是该种方 法在需要用到KOH水溶液、Tween-20水溶液、TE缓冲液和BSA水溶液，而且BSA水溶液需要 用20-25ym孔径的微孔滤膜过滤后使用，过程繁琐，成本较高。因此，提供一种取样少，成 本低、快速高效的制备PCR扩增模板的方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速制备PCR扩增模板的方 法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是： -种快速制备PCR扩增模板的方法，包括以下步骤： (1)向1. 5毫升离心管中加入100微升TEbuffer; (2)将测试材料置于1. 5毫升离心管中，进行离心； (3)离心后，将离心管置于_20°C冰冻30min; ⑷取出冰冻的离心管，水浴加热10分钟； (5)水浴后，将离心管置于离心机中离心分离； (6)取离心后的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩增的模板。 所述TEbuffer为 0.Olmol的Tris-HCl和 0.OOlmol的EDTA二钠盐定容至 1 升， 调节PH至8. 0,经高压蒸汽灭菌。 所述测试材料为3毫米X3毫米草鱼鳍条。 所述步骤4中水浴加热温度为37-95°C 所述步骤4中水浴加热温度为55°C。 所述步骤5中离心条件为：13000转/分、常温、2分钟。 注：本专利技术制备方法中测试材料的大小、冰冻温度及时间、水浴温度及时间、离心 条件等参数是专利技术人在大量的实验基础上总结得出的，在保证所制备的模板满足PCR扩增 条件的同时，最大程度的降低制备时间，不应视为本领域常规技术手段。 本专利技术优点在于： 1、取样量少，只需3毫米X3毫米的组织样品，对受试材料几乎没有伤害，完全可 以满足受试材料活体分析的需要。 2、本专利技术的方法简单、切实可行，只需将样品于PCR板中冷冻、融化、离心、吸上 清，可使用96孔PCR板进行批量制备。 3、快速高效，整个制备过程只需40分钟，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验 操作步骤，不需要使用昂贵的仪器。 4、避免了传统方法中氯仿、异戊醇等对人体有害的化学试剂。【附图说明】 附图1是实施例1的PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上的电泳结果。其中点样孔1-6 分别为水浴温度为37、55、60、72、80、95°0得到的？0?扩增产物，点样孔7为02000，点样孔 8-13为传统方法提取DNA后的PCR扩增产物，最下面一条较弱条带为引物二聚体。 附图2是实施例2中制备得到的PCR扩增模板浓度及OD值。 附图3是实施例2的PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上的电泳结果。其中点样孔0 为D2000 ;点样孔1-6、7-12、13-18、19-24分别为一个个体对应的6对不同引物（表1)。点 样孔1、7、14、19为引物(^(11529对应的不同个体，2、8、15、20为引物(^(11525对应的不同个 体，3、9、13、21为引物Cid0909对应的不同个体，4、10、16、22为引物(^(10058对应的不同个 体，5、11、17、21为引物(^(10036对应的不同个体，6、12、18、24为引物(^(10004对应的不同 个体。最下面的较弱条带为引物二聚体。【具体实施方式】 下面结合附图对本专利技术提供的【具体实施方式】作详细说明。 实施例1快速制备PCR扩增模板及效果验证（一）一、PCR扩增模板的制备 (1)在1. 5毫升灭菌离心管中加入100微升TEbuffer，TEbuffer为0?Olmol的 Tris-HCl和0.OOlmol的EDTA二钠盐定容至1升，调节PH至8. 0,经高压蒸汽灭菌锅灭菌； (2)取3毫米X3毫米草鱼鳍条于步骤1离心管中，用剪刀将组织剪碎； (3)将步骤2中离心管在离心机上进行离心，并置于-20摄氏度冰箱中冰冻0. 5小 时； (4)取出冰冻的离心管，在水浴锅中水浴（温度梯度分别为37、55、60、72、80、 95°C)融化10分钟，期间可轻摇试管，将组织混匀； (5)将步骤4中离心管在离心机上进行离心，离心条件为：13000转/分、常温、2分 钟； (6)取步骤5离心后离心管中的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩增的模板。 二、效果验证 a.对PCR扩增模板进行扩增。反应体系为20yL体系：10yL的2XTaqPCRMaster Mix(不含染料），2yL的DNA模板，7yL的ddH20,上下游引物0. 5yL。反应条件为：94°C 预变性2min; ;94°C变性50S，58°C退火30S，72°C延伸30S，共2个循环；94°C变性50S，55°C 退火30S，72°C延伸30S，共35个循环；72°C延伸lOmin。PCR扩增所使用的引物CID0001 (引 用FuJ,ShenY,XuX,etal.MultiplexmicrosatellitePCRsetsforparentage assignmentofgrasscarp(Ctenopharyngodonidella).AquacultureInternation al, 2013, 21 (6) : 1195-1207)见表 1 : 表1PCR扩增所使用的引物【主权项】1. 一种快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 向1. 5毫升离心管中加入100微升TE buffer ; (2) 将测试材料置于1. 5毫升离心管中，进行离心； (3) 离心后，将离心管置于-20°C冰冻30min ; (4) 取出冰冻的离心管，水浴加热10分钟； (5) 水浴后，将离心管置于离心机中离心分离； (6) 取离心后的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速制备PCR扩增模板的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向1.5毫升离心管中加入100微升TE buffer；(2)将测试材料置于1.5毫升离心管中，进行离心；(3)离心后，将离心管置于‑20℃冰冻30min；(4)取出冰冻的离心管，水浴加热10分钟；(5)水浴后，将离心管置于离心机中离心分离；(6)取离心后的上清液于新离心管，即得到用于PCR扩增的模板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李家乐，张猛，沈玉帮，傅建军，徐晓雁，孙俊龙，党云飞，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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