本发明专利技术涉及家蚕基因技术，具体为家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO。1所示；该启动子是通过设计特别的引物并进行PCR扩增而获得的；本发明专利技术还涉及重组载体，具体为BmCP283-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[BmCP283-DsRed-SV40，3xP3EGFP]重组载体；该启动子及其重组表达载体可以用于调控家蚕蛹后期特异表达外源蛋白或特异干扰某一基因表达，进而实现蛹期发育调控，最终解决鲜茧收烘与蛹发育过短之间的矛盾，改革蚕茧收购-烘干-缫丝的传统生产模式，促使生丝加工工艺的重大改革并显著提高生丝品质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因
，特别涉及家蚕BmCP283基因启动子及其运用。
技术介绍
家蚕属于全变态昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹和成虫4个形态特征和生理功能显著不同的发育阶段。从幼虫吐丝完毕至成虫羽化的阶段被称为变态期，包含幼虫-蛹和蛹-蛾的变态。作为重要的经济昆虫，家蚕在生产上主要用于结茧缫丝。家蚕在幼虫末期熟蚕时开始上蔟吐丝，经过3日左右吐丝终了，再经过1 2日蜕皮化蛹，经两周左右羽化成蛾，交配产卵。生产上必须在幼虫化蛹后且化蛾前完成鲜茧的收购，然后利用热能或其他方法烘死蚕蛹和寄生蝇蛆，防止出蛾、出蛆、霉变，并除去蛹体及茧层的自由水分以达到长期安全贮藏的目的。由于时间紧迫，而且要保证蚕茧收购、运输和烘干的顺利进行，给生产造成了一定难度。又由于茧丝成分主要是蛋白质，高温烘烤使蚕丝品质受到破坏，影响后加工。因此，如果能通过遗传改良等方法使蛹期发育延长或停滞，这将有助于解决鲜茧收烘与蛹发育过短之间的矛盾，改革蚕茧收购-烘干-缫丝的传统生产模式，促使生丝加工工艺的重大改革并显著提高生丝品质。在遗传上实现家蚕蛹期发育调控主要涉及两个关键问题，一是有用于使蛹期发育延长或停滞的靶基因，该基因的转录沉默或超量表达能对蛹期发育进行有效的控制；二是使候选靶基因在蛹期(化蛾前)特异表达，如果在胚胎、幼虫或成虫等其他发育阶段发挥作用，势必达不到预期效果，甚至会影响正常的蚕茧产量。因此，蛹期特异的启动子是实现该目标的重要保证，但至今相关研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子为家蚕蛹期特异性启动子。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。家蚕BmCP283基因启动子的截短片段，所述截短片段为如SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。本专利技术的目的之二在于提供一种启动子得制备方法，该方法操作简单，适用于普通实验室使用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述的家蚕BmCP283基因启动子的制备方法，具体步骤为以家蚕基因组为模板进行 PCR扩增，其中上游引物如SEQ ID N0:2所示，下游引物如SEQ ID N0:3所示;扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，59. 9°C退火30秒，72 °C延伸90秒， 共30个循环；最后72 °C延伸10分钟，得如SEQ ID NO: 1所示的家蚕BmCP283基因启动子。本专利技术的目的之三在于提供一种重组表达载体，其能对蛹期发育进行有效的控制。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为 所述的家蚕BmCP283基因启动子的重组载体。进一步，所述重组载体为BmCP283-DsRed-SV40片段同基础载体 pBac 连接而成的 pBac 的重组载体；本专利技术的目的之四在于提供一种所述重组载体的制备方法，该方法适用于普通实验室。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述的重组载体的制备方法，将经酶切的如SEQ ID NO: 1所示的家蚕BmCP283基因启动子与经同样酶切的含有具备表达外源蛋白的基因的载体片段连接，得显微注射载体。进一步，酶切所述显微注射载体后与经同样酶切的含有荧光蛋白标签的基础载体连接，得含有荧光蛋白标签的显微注射载体；进一步，将如SEQ ID N0:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组载体，分别用Ml I和BamH I双酶切pMD19- BmCP283质粒，回收家蚕BmCP283基因启动子与分别用Ml I和BamH I双酶切的pSL载体片段进行连接，构建成pSL；进一步，用Asc I酶切步骤B所得pSL ，将酶切所获得的 BmBmCP283-DsRed-SV40片段连接到Asc I酶切的pBac DxPS-EGFI^afm]基础载体，构建成ρ Bac 显微注射载体。本专利技术的目的之五在于提供所述家蚕BmCP283基因启动子的应用，该应用为实现家蚕蛹期发育调控提供了新思路。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述的家蚕BmCP283基因启动子在家蚕蛹后期表达外源蛋白的应用。本专利技术的有益效果为BmCP283基因在家蚕蛹后期特异表达，利用该基因的启动子使外源基因在特定时期表达，将有助于实现人为调控家蚕蛹期发育，实现蛹期发育的延长或停滞的最终目标。利用BmCP283基因启动子的蛹期特异性，构建GAL4 / UAS转基因系，将蛹期特异启动子与酵母转录激活因子GAL4相连接，建立GAL4转基因系，使蛹期特异启动子以时空特异性的方式激活GAL4的表达；同时将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。将两个转基因系进行杂交，在杂交后代中，由于GAL4蛋白只能与UAS相结合，那么特异性表达的GAL4就可以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。靶基因的选择可以根据需要进行，如致死基因，通过蛹期特异性启动子启动致死基因在家蚕化蛾前表达，从而避免茧层破坏以及鲜茧烘干对蚕丝品质的破坏，实现蛹期发育调控的最终目标。更多的有益效果，将在实施例中体现。附图说明图1为包含不同长度的BmCP283启动子的载体转染sf9细胞后的活性分析。图2为转基因家蚕个体的荧光观察后的灰度处理照片，A 卵(白光下)B 卵(荧光下)C 成虫(白光下)D 成虫(荧光下)。 图3为BmCP^3P启动子转基因阳性个体中/fei/基因的胚胎期表达特征； M:DL2000plus ;1:产卵5天；2:产卵6天；3:产卵7天；4:产卵8天；5:产卵9天；6:蚁蚕。图4为BmCP^3P启动子转基因阳性个体中Tfei/基因的幼虫期表达特征； M:DL2000plus ；1:1 龄眠；2:2 龄起；3:2 龄眠；4:3 龄起；5:3 龄眠；6:4 龄起；7:4 龄眠；8:5龄起。图5为家蚕转基因阳性个体中红色荧光蛋白基因mRNA表达谱的时期特异性；胚胎期M:DL2000plus ； 1:产卵5天；2:产卵6天；3:产卵7天；4:产卵8天；5:产卵9 天；6:蚁蚕幼虫期M:DL2000plus ;1:1龄眠；2:2龄起；3:2龄眠；4:3龄起；5:3 龄眠；6:4龄起；7:4龄眠；8:5龄起变态期M:DL2000plus ； 1:5龄第3天对照；2:5 龄第3天转基因品系1;3:5龄第5天转基因品系2;4:刚上蔟对照；5:刚上蔟转基因品系 1;6:刚上蔟转基因品系2; 7:上蔟第3天对照；8:上蔟第3天转基因品系1 ； 9:上蔟第 3天转基因品系2 ； 10:化蛹第4天对照；11:化蛹第4天转基因品系1 ;12:化蛹第4天转基因品系2 ;13:化蛹第5天对照；14:化蛹第5天转基因品系1 ;15:化蛹第5天转基因品系 2 ；16:化蛹第6天对照；17:化蛹第6天转基因品系1 ;18:化蛹第6天转基因品系2 ;19: 化蛹第7天对照；20:化蛹第7天转基因品系1 ；21:化蛹第7天转基因品系2 ；22:化蛹第 8天对照；23:化蛹第8天转基因品系1 ;24:化蛹第8天转基因品系2 ;25:蛾对照；26:转基因品系1的蛾；27:转基因品系2的蛾。图6为BmCP^3P启动子转基因阳性个体中Tfei/基本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．家蚕ＢｍＣＰ２８３基因启动子，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程道军，夏庆友，唐林，徐汉福，马三垣，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85
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