一种伤寒Vi多糖纯化工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种伤寒Vi多糖纯化工艺，该工艺在纯化过程中不使用苯酚来去除蛋白，避免了苯酚的使用，不需进行酚提后的透析步骤，缩短了生产时间，提高了生产效率。由于工艺过程中不使用苯酚，因此疫苗中不含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险，对接种者健康更有利，也有利于保护生产人员的身体健康和生态环境，克服了传统工艺大量使用苯酚的不足。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及伤寒Vi多糖疫苗生产工艺(菌种制备、原液制备、半成品制备、成品制备)中原液制备中的多糖纯化工艺。
技术介绍
伤寒是由伤寒杆菌引起的经消化道传播的严重急性传染病，在发展中国家为常见肠道传染病，尤其在学龄儿童中发病率较高。据2000年数据统计，全球伤寒病人数约为 2100万例，21万人死亡，亚洲和非洲南部地区发病率最高^近年来中国伤寒总发病数一直居法定报告传染病的前数位，部分省(自治区、直辖市)发病率> 10/10万，成为高发地区。自19世纪末首次应用伤寒菌体菌苗预防伤寒以来，各国先后研制出10余种伤寒菌苗，其中的多数，由于免疫效果差或副作用大而被淘汰或被限制使用。1984年，美国国立卫生研究院RcAbins等在对伤寒杆菌Vi抗原的保护性进行了重新评估后，通过改进提纯方法，采用提纯的Vi荚膜多糖制备了新一代Vi多糖疫苗2。目前，只有Vi多糖疫苗和Ty21a 口服减毒活疫苗是安全、有效的，并被WHO推荐使用3。中国药品生物制品检定所和成都、兰州、长春、武汉、北京、上海生物制品研究所共同成立了伤寒Vi多糖菌苗研制协作组。并于 1992年研制成功。传统工艺中用苯酚抽提来达到去除蛋白的目的，但苯酚是一种毒性物质，对人有毒性作用，纯化过程中使用苯酚去除蛋白杂质，在后续处理步骤中采取透析或超滤的方法虽可将苯酚含量降至安全限度内(见中国药典有关多糖类制品规程原液检定项目中苯酚残留检测项)，但在理论上不可能完全将苯酚去除干净，人群接种疫苗时也吸收了苯酚，苯酚含量虽在安全限度内，但对人仍有潜在风险；在生产过程中一般要用苯酚抽提3 4次， 生产人员在每批次的生产中长时间会处于苯酚的环境中，虽有保护措施，但苯酚的使用仍对生产人员有伤害的风险；使用后废酚的处理也是高风险环节，将废酚直接排放将严重破坏生态环境，若将废酚回收再利用在运输和蒸馏环节同样有破坏环境的风险。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供一种伤寒Vi多糖纯化工艺，使其具有生产过程中不使用苯酚，疫苗中不会含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险等特点，以克服现有技术的不足。实现本专利技术的技术方案是本专利技术提供的这种伤寒Vi多糖纯化工艺，包括以下步骤步骤一已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液；步骤二 向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.06% 0. 10%，混勻，2 8°C存放4 对小时，形成沉淀；步骤三离心收取沉淀物，用0. 5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；步骤四向解离液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为30%，2 8°C存放3 对小时，离心收集上清液；步骤五将上清液经无石棉澄清滤板K700过滤，过滤时压力为0. 03 0. 05Mpa ；步骤六将K700滤过液经无石棉除菌滤板EKS过滤，过滤时压力为0. 03 0.05MPa ；步骤七向EKS滤过液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后的多糖按200 300毫升/克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。本专利技术工艺在纯化过程中不使用苯酚来去除蛋白，避免了苯酚的大量使用，不需进行酚提后的透析步骤，缩短了生产时间，提高了生产效率。由于工艺过程中不使用苯酚， 因此疫苗中不含苯酚，接种疫苗的对象就不会接触苯酚，不会有被苯酚伤害的风险，对接种者健康更有利；生产人员不会接触苯酚，生产人员身体健康得到保护，免受苯酚伤害；不使用苯酚同时还可保护环境，避免破坏生态环境。实验目的建立一种伤寒Vi多糖的纯化方法，在该方法中不使用苯酚抽提来去除蛋白，制备合格的多糖。实验方法设计用连续6 批伤寒菌培养液(培养批号:20021110、20021111、20021112、20021213、 20021214、200212巧)，每批培养液，分别经本专利技术工艺和传统工艺进行多糖原液的制备，共制得12批多糖原液其中传统纯化工艺制备为标记为-1，本专利技术纯化工艺制备标记为-2。将其中经本专利技术工艺制备的3批多糖原液Q0021110-2、20021111-2、20021112-2)稀释分装， 制成成品。实验步骤1.培养和杀菌按《中华人民共和国药典(三部)》中“伤寒Vi多糖疫苗制造检定规程”和本所企业标准规定工艺执行。2 纯化2. 1传统工艺2. 1. 1已杀菌的培养液经连续流离心法后收集上清液。2. 1. 2向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0. 06% 0. 10%，混勻， 2 8°C存放4 M小时，形成沉淀。2. 1. 3离心收取沉淀物，并用0. 5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离。2.1.4向解离液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为25%，2 8°C存放3 M小时， 离心收集上清液。2. 1. 5于上清液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为80%，使多糖沉淀，离心收集沉淀。沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后即为多糖粗制品。2. 1. 6将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性乙酸钠溶液中，使其浓度达5 20mg/ ml ；按1 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和乙酸钠溶液)提取3次，离心收集上清液，并用注射用水透析。2. 1. 7向透析液中加入乙醇至乙醇终浓度为75%，沉淀多糖，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。2. 2本专利技术工艺2. 2. 1已杀菌的培养液经连续流离心法后收集上清液。2. 2. 2向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0. 06% 0. 10%，混勻， 2 8°C存放4 M小时，形成沉淀。2. 2. 3离心收取沉淀物，并用0. 5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离。2.2.4向解离液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为30%，2 8°C存放3 M小时， 离心收集上清液。2. 2. 5将上清液经K700滤板过滤，过滤时压力不超过0. 05MPa。2. 2. 6将K700滤过液经EKS滤板过滤，过滤时压力不超过0. 05MPa。2.2.7向EKS滤过液中加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%，离心收集的沉淀物用无水乙醇和丙酮洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。2. 3成品制备将经本专利技术工艺制备的3批伤寒Vi多糖原液(20021110、20021111、 20021112)稀释分装为成品。2. 4原液检定对12批多糖原液依照《中华人民共和国药典(三部)》中伤寒Vi多糖疫苗规程中方法进行蛋白含量、核酸含量、0-乙酰基含量、多糖分子大小测定各项检定。 传统工艺及本专利技术工艺所制备原液检定结果分见表1、表2。表1传统工艺制备原液检定结果权利要求1. 一种伤寒Vi多糖纯化工艺，包括以下步骤 步骤一已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液；步骤二 向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0. 06% 0. 10%，混勻，2 8°C存放4 M小时，形成沉淀；步骤三离心收取沉淀物，用0. 5mol/L的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌2小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；步骤四向解离液中加入95%本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种伤寒Ｖｉ多糖纯化工艺，包括以下步骤：步骤一：已杀菌的培养液经离心去菌体收集上清液；步骤二：向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度０．０６％～０．１０％，混匀，２～８℃存放４～２４小时，形成沉淀；步骤三：离心收取沉淀物，用０．５ｍｏｌ／Ｌ的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌２小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离；步骤四：向解离液中加入９５％乙醇至乙醇终浓度为３０％，２～８℃存放３～２４小时，离心收集上清液；步骤五：将上清液经无石棉澄清滤板Ｋ７００过滤，过滤时压力为０．０３～０．０５Ｍｐａ；步骤六：将Ｋ７００滤过液经无石棉除菌滤板ＥＫＳ过滤，过滤时压力为０．０３～０．０５ＭＰａ；步骤七：向ＥＫＳ滤过液中加入９５％乙醇至乙醇终浓度为７５％，离心收集的沉淀物依次用无水乙醇和丙酮洗２次，干燥后的多糖按２００～３００毫升／克加入灭菌注射用水溶解，经除菌过滤即为精制多糖原液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾令冰，项美娟，袁军，杨邦云，孙晓芳，朱红伟，孙建，薛红钢，李新国，陈有喜，张潇文，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：83