本发明专利技术提供了一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株及其菌剂的制备方法。本发明专利技术将选择因子作为富集培养过程中选择压力，淘汰非目标菌群，建立了一种快速、高效获得目标菌株的方法。利用该筛选方法从实验样品中筛选出了一株高效降解亚硝酸盐的菌株，鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus?cereus)，保藏编号为：CGMCC?NO.4918。其可以利用亚硝酸盐作为唯一的氮源进行生长繁殖，对环境有较强的适应能力，在实际工程应用中有较大的发展潜力。本发明专利技术还公开了以该菌株制备水质净化微生物制剂的生产方法，生产出的菌剂可用于污水处理、水产养殖、水族箱或流动水系等水治理工程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效异养硝化细菌筛选方法、筛选的菌株以及菌剂的制备方法， 生产出的水质净化微生物制剂可用于污水处理、水产养殖、水族箱或流动水系等水治理工程，属于利用微生物对污水治理的
技术介绍
近年来，亚硝酸盐对人和动物毒性己引起重视，对亚硝酸盐中毒的病理学的研究很多。动物亚硝酸盐中毒最明显的特征是，血液中高铁血红蛋白(MHb)的含量升高，红细胞的载氧能力下降，造成组织缺氧，神经麻痹，甚至窒息死亡，国外称之为“褐血症”(Brown Blood)。亚硝酸盐对人类健康的影响集中于二点，一是可引起高铁血红朊症，二是亚硝酸盐在人体内形成有致癌危害的亚硝胺。亚硝酸盐是氨转化为硝酸盐过程中的中间产物，在养殖水体中由于大量的投饵而留下的残饵、水体中水生动物的大量排泄物的累积和定期使用的消毒药剂，把有害和有益的细菌同时大量杀灭，氧气的供应不足，造成大量累积的氨氮硝化过程受阻，形成养殖时水中氨氮和亚硝酸氮含量高。据长期在各地养殖塘的监测，发现有50%以上的养殖鱼塘会出现亚硝酸盐含量超标，国外也有提到亚硝酸盐积累是常见的水质现象。更值得重视的是水中亚硝酸盐含量超标目前已成为鱼虾养殖水质调控最棘手的问题。现在，控制亚硝酸盐水平是水产养殖的重要工作方向。解决好水产养殖亚硝态氮问题，将会促进我国经济和环境保护方面的可持续性发展。传统对亚硝态氮的处理主要有换水法、化学氧化法及物理吸附法等，但都存在治标不治本或产生二次污染的问题。微生物修复指利用微生物的生命代谢活动降低环境中的有毒有害物质的浓度使其无害化，从而使被污染的环境能够部分或完全恢复到初始状态的过程，具有效果好、投资少、安全性高等特点。目前已报道的亚硝酸盐降解菌主要有硝化杆菌属(Nitrobacter sp.)、石肖化螺菌属(Nitrospira sp.)禾口石肖化球菌属(Nitrococcus sp.) 等。但该类菌均为专性化能自养菌，对底物的要求专一性很强，严格好氧，且其生长缓慢，平均世代时间在IOh以上。正是这些菌的自身特性所局限，目前国内外亚硝酸盐降解菌菌剂的开发和使用程度较低，国外的产品价格比较昂贵，且主要用于水族箱等观赏水生生物的养殖。但近来的研究表明，有些异养微生物也能进行硝化作用，如脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)禾口红球菌(I h0d0C0CCUS sp.)等。与自养硝化细菌相比，异养硝化细菌具有生长速率快、要求溶解氧浓度低、能耐受更酸环境的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对高浓度亚硝酸盐的耐受能力强、亚硝酸盐去除率高的异养硝化细菌的筛选方法、筛选得到的菌株以及以该菌株制备水质净化微生物制剂的生产方法。该方法所得到的异养硝化细菌——经中国科学院微生物研究所鉴定为蜡状芽孢杆菌，能够较快的适应环境，生长速率高，对低浓度和高浓度含亚硝酸盐的污水均有很强的降解能力。本专利技术以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株所制得的水质净化微生物制剂，活菌数高， 发酵周期短，发酵工艺简便。所制得的产品能有效的缓解养殖水体中亚硝酸盐超标的现状， 降低环境污染。一种高效异养硝化细菌筛选方法，包括以下步骤(1)配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化所用富集培养基配方如下葡萄糖5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、 FeSO4 · 7Η200· 02g、CaCl2O. Olg、NaNO2O. 1 2g、水 1L, ρΗ7· 2 ；将 IOml 含异养硝化细菌的活性污泥接种于90ml富集培养基中，在30°C、180r/min的条件下恒温震荡培育，1 2d后，取上清液5ml加至IOOml新鲜的富集培养基中相同条件下培养，如此反复5次；每次逐渐提高培养液中NaNO2的浓度，其中NaNO2初始浓度为0. lg/L，然后提高至0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L， 最终浓度为2g/L ；(2)将富集培养后的菌株转至平板培养，分离纯化，获得降解率高的菌株。一株高效异养硝化细菌是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏编号为CGMCC NO. 4918。一种水质净化微生态制剂的制备方法以所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，经过摇床种子培养和液体发酵进行制备。采用LB培养基，300C，培养Mh，获取新鲜斜面菌种用于种子培养。所述摇床种子培养条件为pH 7. 2、温度30°C，转速180 200r/min，培养10 12h ；培养基的组成为葡萄糖 5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4. 7H20 0. 05g、FeSO4. 7H20 0. 02g、 CaCl2O. Olg、NaNO2O. 5g、H2O 1L。所述液体发酵条件为20L罐装量为12L，搅拌速度200 220r/min，初始pH 7.0 7.2，通气量1 (0.9 1)，接种量3% (接种摇床种子培养液)J8 30°C温度下发酵M ^h ；培养基组成为玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 5g/L， MgSO4. 7H20 lg/L, K2HP042g/L, MnSO4. H2O 0. 05g/L, CaCO3 0. 01g/L，其余为水。本专利技术的异养硝化细菌筛选方法按照下述具体步骤进行一、采集含有土著异养硝化细菌的样品实验中的样品采集于湖南省长沙市某小龙虾养殖基地，采集点为塘边3cm深的潮湿活性污泥。二、配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化所用富集培养液主要组分为无机盐，包括微量元素狗、Mg、Ca等，配方如下葡萄糖 5g、K2HP040. 5g、MgS04. 7H20 0. 05g、FeS04. 7H20 0. 02g,CaCl2O. Olg^NaNO2O. 1 2g、水 1L， pH7. 2。其中微量元素1 是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体氧代谢不可或缺的元素，该配方中以FeSO4. 7H20的形式加入；Mg参与多种辅酶和激活因子的合成，其对ATP酶有激活作用，可促进细胞内ATP的生成，从而加快菌体的生长，该培养基中以MgSO4. 7H20的形式加入；Ca是一些酶的激活剂，并且参与多种信号传导过程，该配方中以CaCl2的形式加入。NaNO2是该培养基中的唯一氮源，同时亦为细菌的生长提高能源。将IOml活性污泥接种于90ml富集培养基中，在30°C、180r/min的条件下恒温震荡培育1 2d后，利用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009. 33-2008)测剩余亚硝酸盐的浓度，当亚硝酸盐浓度降到10mg/L以下时，取上清液5ml加至IOOml新鲜富集培养基中相同条件培养，如此反复5次。每次逐渐提高培养液中NaNO2的浓度，其中NaNO2初始浓度为 0. lg/L，然后提高至 0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L，最终浓度为 2g/L。本专利技术将NaNO2作为选择因子作为富集培养过程中选择压力，淘汰非目标菌群，通过逐渐提高培养液NaNO2浓度的方法进行富集，其中NaNO2初始浓度为0. lg/L，最终浓度为2g/L。本专利技术方法可使污泥中的碳化菌等杂菌的生长明显受到抑制，有利于本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高效异养硝化细菌筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化：所用富集培养基配方如下：葡萄糖５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２０．０１ｇ、ＮａＮＯ２０．１～２ｇ、水１Ｌ，ｐＨ７．２；将１０ｍｌ含异养硝化细菌的活性污泥接种于９０ｍｌ富集培养基中，在３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ的条件下恒温震荡培育，１～２ｄ后，取上清液５ｍｌ加至１００ｍｌ新鲜的富集培养基中相同条件下培养，如此反复５次；每次逐渐提高培养液中ＮａＮＯ２的浓度，其中ＮａＮＯ２初始浓度为０．１ｇ／Ｌ，然后提高至０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ，最终浓度为２ｇ／Ｌ；（２）将富集培养后的菌株转至平板培养，分离纯化，获得降解率高的菌株。
【技术特征摘要】
1.一种高效异养硝化细菌筛选方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制硝化细菌富集培养基，对菌种进行扩培和驯化所用富集培养基配方如下葡萄糖5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、 FeSO4 · 7Η200· 02g、CaCl2O. Olg、NaNO2O. 1 2g、水 1L, ρΗ7· 2 ；将 IOml 含异养硝化细菌的活性污泥接种于90ml富集培养基中，在30°C、180r/min的条件下恒温震荡培育，1 2d后，取上清液5ml加至IOOml新鲜的富集培养基中相同条件下培养，如此反复5次；每次逐渐提高培养液中NaNO2的浓度，其中NaNO2初始浓度为0. lg/L，然后提高至0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L， 最终浓度为2g/L ；(2)将富集培养后的菌株转至平板培养，分离纯化，获得降解率高的菌株。2.一株高效异养硝化细菌，其特征在于，是一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏编号为CGMCC NO. 4918。3.一种水质净化微生态制剂的制备方法，其特征在于以权利要求2所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，经过摇...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，贺月林，尹红梅，张德元，吴迎奔，许丽娟，王震，
申请(专利权)人：湖南省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：43
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