本发明专利技术公开的从动物血球液中提取超氧化物歧化酶的新工艺，主要步骤包括动物新鲜血液抗凝处理后，离心分离血球，经溶血，热变性，超滤浓缩，丙酮分级沉淀得SOD粗品。粗品经阴离子交换树脂或分子筛层析纯化后冷冻干燥得SOD精品。本发明专利技术不仅放弃了氯仿乙醇，而且在热变性的过程中不添加过渡金属盐如铜盐、锌盐、锰盐中的任何一种，在此基础上进一步引入超滤浓缩工艺，在丙酮分级沉淀过程中丙酮的用量极少。本发明专利技术提取SOD的新工艺能最大限度的保证原有SOD的活力，操作简单，成本低廉，适合大规模的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种超氧化物歧化酶SOD的提取工艺，特别是一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺。
技术介绍
超氧化物歧化酶，简称S0D，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内。在体内，SOD能专一清除过多的氧自由基，有效地防御活性氧对生物体的毒害作用，对由超氧阴离子自由基引起的疾病有明显的治疗作用；在体外，SOD具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力等多种功能，现广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等行业，市场前景十分广阔。自上世纪70年代，国外首次报道采用多级沉淀法纯化了 CuSi-SOD。到目前为止， 国内外的生物学、化学和医药学工作者已采用不同方法从不同的生物资源中分离到了 SOD 的纯品。这些制备方法主要有溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等，但这些方法多数类同，成本高、工艺繁杂，局限于实验室小规模制取，与SOD的市场需求不适应。动物血液是国内外正在生产SOD的主力资源，最常见是牛羊的血液。在我国，有着最为丰富的猪血资源，而且价格低廉，具有独特的加工优势。但是由于加工工艺的不完善， 以致我国绝大部分动物血液资源未能开发利用，造成宝贵资源严重浪费和环境污染。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，利用该工艺方法提取SOD工艺简捷、成本低廉、操作方便，适合工业化生产的新工艺。如上构思，本专利技术的技术方案是一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD 的新工艺，其特征在于依照下列步骤完成(1)在新鲜的动物血液中加入柠檬酸钠做抗凝处理，离心收集红细胞，然后加入红细胞体积1-3倍的去离子水，不断搅拌，使红细胞破碎，得溶血液；(2)向溶血液中加入单价中性金属盐，调节PH值到4. 0-7. 0，加热至55_75°C，保温反应30-100min，冷却至室温，离心取上清，得SOD粗提液；(3)用中空纤维超滤装置对SOD粗提液进行超滤浓缩得SOD浓缩液；(4)向SOD浓缩液中边搅拌边缓慢加入0. 4-1倍体积的预冷丙酮，离心取上清液；(5)然后向步骤(4)所得的清液中边搅拌边缓慢加入1. 2-1. 5倍体积的预冷丙酮， 离心取沉淀；(6)将沉淀用去离子水溶解，经过阴离子交换树脂或分子筛层析，冷冻干燥即可得 SOD精品冻干粉。上述抗凝处理时所使用的抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量为3. 5_5g/Kg动物血，搅拌溶血时间30-120min。上述单价中性金属盐可以是碱金属的氯化物、溴化物、硝酸盐和硫酸盐中的任一种或几种的混合物，至其终浓度为0. 1-1. 5mol/L。上述步骤C3)使用的中空纤维超滤装置选择截留分子量为4K-MK的膜组件，保持回流压 0. 04-0. IMPa0上述步骤(6)中使用的阴离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，层析柱先用 pH6. 5 8. 0的2. 5mM的磷酸缓冲液平衡，至^Onm无光吸收，然后上样，换用单一浓度的洗脱液洗脱至^Onm无光吸收，收集SOD活力峰。其中的单一浓度洗脱液为与平衡层析柱的缓冲液PH相同、浓度为4 SmM的磷酸缓冲液。上述步骤(6)中使用的分子筛柱层析是kphadex GlOO或kphadex G25柱层析， 层析柱先用蒸馏水平衡，然后上样，再以蒸馏水洗脱，收集SOD活力峰。 本专利技术的优点在于(1)不使用乙醇氯仿，大大降低了生产成本，改善了工作环境，减少了对操作人员的毒害；(2)采用热变性去除血红蛋白，溶血过程能在常温下进行，使操作更简便，降低能耗；(3)在以往的SOD提取中，往往添加大量金属盐来提高SOD的活性，但是很容易造成金属离子超标，且得不到纯净的SOD ；本工艺不添加过渡金属盐如铜盐、锌盐、锰盐中的任何一种，既控制了金属盐离子的超标，又节约了大量的成本；(4)引入了超滤浓缩装置，既能有效的对SOD进行一定程度的纯化，又极大的压缩了浓缩液的体积，使得丙酮的用量大幅度的减少，操作起来方便快捷，适合大规模工业化生产。具体实施例方式实施例1(1)采集新鲜猪血175L加入7L浓度为10%的柠檬酸钠抗凝，用管式离心机连续分离得70L血球和112L血浆。血浆经喷雾干燥成血浆蛋白粉，血球泵入反应罐中，同时加入70L的去离子水搅拌60min使血球破碎，制得溶血液140L ；(2)继续搅拌下，向溶血液中加入氯化钠4. 06Kg，然后用10%的盐酸调节PH值至 6. 0，加热到62°C并保温60min，迅速水冷至室温，三足离心机离心收集上清液得SOD粗提液 100L ；(3)粗提液经截留分子量为IOK的中空纤维膜超滤浓缩，保持回流压0. 08MPa，得 SOD浓缩液IL ；(4)浓缩液在搅拌下加入IL的4°C预冷丙酮，继续搅拌30min，离心收集上清液；(5)收集的上清液在搅拌下加入0. 5L的4°C预冷丙酮，产生大量絮状沉淀，继续搅拌20min后离心，小心收集浅蓝色的沉淀；(6)沉淀用800mL的pH6. 8的2. 5mM的磷酸缓冲液溶解，溶解液上DEAE阴离子交换层析柱进行纯化，上样后用PH6. 8的5mM的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD活力峰。SOD液冷冻干燥得浅蓝色的精品冻干粉3. 86g，比活力6100U/mg，密封包装于_20°C冷冻保存。实施例2 (1)采集新鲜猪血50L，加入175g柠檬酸钠做抗凝处理，用管式离心机分离得20L4血球和30. 17L血浆，血球泵入反应罐中，同时加入40L的去离子水搅拌溶血90min ；(2)继续搅拌下，向溶血液中加入696g氯化钠，用盐酸调节PH至7. 0，加热到70°C 并保温30min，迅速水冷至50°C以下，三足离心机离心收集SOD粗提液52L ；(3)粗体液经截留分子量为6K的中空纤维膜超滤浓缩，保持回流压为0. IMPa^l 提液浓缩至IL ；(4)浓缩液在搅拌下加入0. 5L的4°C预冷丙酮，继续搅拌20min，离心收集上清液；(5)收集的上清液在搅拌下加入0. 8L的4°C预冷丙酮，继续搅拌20min后离心收集沉淀；(6)沉淀用IOOmL的蒸馏水溶解，溶解液上分子筛柱层析进行纯化，上样后用蒸馏水洗脱，收集SOD活力峰。体积300mL左右的SOD纯化液冷冻干燥得冻干粉1. 03g，比活力 6500U/mg，密封包装后-20°C冷冻保存。以下通过具体实施例对本专利技术进行阐释，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚，以下实施例涉及到的SOD活性检测使用GB/T 5009. 171-2003第一法。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但是这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶ＳＯＤ的新工艺，其特征在于：依照下列步骤完成：（１）在新鲜的动物血液中加入柠檬酸钠做抗凝处理，离心收集红细胞，然后加入红细胞体积１－３倍的去离子水，不断搅拌，使红细胞破碎，得溶血液；（２）向溶血液中加入单价中性金属盐，调节ＰＨ值到４．０－７．０，加热至５５－７５℃，保温反应３０－１００ｍｉｎ，冷却至室温，离心取上清，得ＳＯＤ粗提液；（３）用中空纤维超滤装置对ＳＯＤ粗提液进行超滤浓缩得ＳＯＤ浓缩液；（４）向ＳＯＤ浓缩液中边搅拌边缓慢加入０．４－１倍体积的预冷丙酮，离心取上清液；（５）然后向步骤（４）所得的清液中边搅拌边缓慢加入１．２－１．５倍体积的预冷丙酮，离心取沉淀；（６）将沉淀用去离子水溶解，经过阴离子交换树脂或分子筛层析，冷冻干燥即可得ＳＯＤ精品冻干粉。
【技术特征摘要】
1.一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，其特征在于依照下列步骤完成(1)在新鲜的动物血液中加入柠檬酸钠做抗凝处理，离心收集红细胞，然后加入红细胞体积1-3倍的去离子水，不断搅拌，使红细胞破碎，得溶血液；(2)向溶血液中加入单价中性金属盐，调节PH值到4.0-7. 0，加热至55-75°C，保温反应 30-100min,冷却至室温，离心取上清，得SOD粗提液；(3)用中空纤维超滤装置对SOD粗提液进行超滤浓缩得SOD浓缩液；(4)向SOD浓缩液中边搅拌边缓慢加入0.4-1倍体积的预冷丙酮，离心取上清液；(5)然后向步骤(4)所得的清液中边搅拌边缓慢加入1.2-1. 5倍体积的预冷丙酮，离心取沉淀；(6)将沉淀用去离子水溶解，经过阴离子交换树脂或分子筛层析，冷冻干燥即可得SOD 精品冻干粉。2.根据权利要求1所述的从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，其特征在于上述抗凝处理时所使用的抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量为3. 5-5g/Kg动物血，搅拌溶血时间30-120min。3.根据权利要求1所述的从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SO...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶跃国，臧盛，王雅静，卢进峰，方俊生，袁训安，尹伦，
申请(专利权)人：天津宝迪农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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