一种含有loxP-kanr-loxP片段的重组质粒载体p18-kan±的构建方法，它涉及一种重组质粒载体的构建方法。方法：1、从pUG6质粒中获得loxP-kanr-loxP片段；2、以pMD18-T载体作为骨架，通过T-A末端连接获得连接产物；3、连接产物转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒即完成。本发明专利技术利用pMD18-T载体作为模板，向其多克隆位点上引入loxP-kanr-loxP基因片段，同时构建出一对连接方向相反的重组质粒，质粒loxP-kanr-loxP位点两端具有多个常用酶切位点，外源基因便于与loxP-kanr-loxP片段连接，为真核生物基因敲除、替换提供了新的操作途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组质粒载体的构建方法。
技术介绍
在进行真核生物基因敲除、替换等实验过程中，往往会用到karf基因作为筛选标记，应用IoxP位点作为去除抗性标记基因工具位点。在实际应用中，这一功能片段通常是应用融合PCR等互补PCR手段与目的基因重组连接的。但是，在实际操作中往往会因为PCR 错配及引物特异性等不足，使得连接失败或产物基因失活，最终导致实验失败。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf 的构建方法。含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法按以下步骤进行一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得loxP-karf-loxP片段；二、胶回收1.6Kb的 loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb的pMD18_T载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kar^的构建。本专利技术利用pMDIS-T载体作为模板，向其多克隆位点上引入loxP-karf-loxP基因片段，同时构建出一对连接方向相反的重组质粒，该质粒loxP-karf-loxP位点两端具有多个常用酶切位点，外源基因便于与loxP-karf-ΙοχΡ片段连接，为真核生物基因敲除、替换提供了新的操作途径。本专利技术PCR获得loxP-karf-loxP基因片段，将其连入到质粒载体pMD18_T多克隆位点中，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体 plS-kaf，经PCR及酶切鉴定，结果与预期结果相符，测序结果显示loxP-karf-loxP片段以两个不同方向成功连入质粒中，含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kar^构建成功。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法按以下步骤进行一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得 loxP-kanr-loxP 片段；二、胶回收 1. 6Kb 的 loxP-karf-loxP 片段，然后以 2. 7Kb 的 pMD18_T 载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-karf-loxP 片段的重组质粒载体Pl8-kan±的构建。本实施方式中pUG6质粒、大肠杆菌DH5 α感受态细胞、pMD18_T载体均为购买得到(NewEngland Biolabs Inc. ,MA,USA)；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂或试剂盒均为购买得到(宝生物工程有限公司)，且使用均按说明书操作。本实施方式步骤二中连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养的具体过程将大肠杆菌DH5ci感受态细胞从-70°C取出，在冰上融化后加入5μ 1连接产物，冰中放置30分钟，然后42°C热休克90秒，再冰浴 2-3分钟，加入37°C预热的S. 0. C培养基900 μ 1，37°C振荡培养1小时(160-200rpm)，然后 4000r/min离心3分钟，弃上清，保留200 μ 1培养基，将沉淀重新混勻后，涂布于氨苄抗性的 LB固体培养基中，37°C培养过夜。本实施方式步骤三中采用碱裂解法提取重组质粒的具体过程随机挑取生长于氨苄抗性的LB固体培养基上的数个白色菌落分别接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C 振荡培养过夜；取1. 5ml培养液于微量离心管中，10, OOOg离心30秒，弃上清，将沉淀重悬于100 μ 1冰预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris_HCI，IOmM EDTA, pH8. 0)中，剧烈振荡以分散沉淀；再加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，颠倒混勻几次后置冰浴5分钟，然后加入150 μ 1溶液III (5Μ乙酸钾60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成)， 颠倒混勻数次，冰浴10分钟后于4°C 12000r/min离心10分钟，取上清加入等体积的酚、氯仿各抽提一次，取上层水相加入1倍体积的异丙醇，-20°C沉淀10分钟；4°C 12000r/min离心15分钟，弃上清，沉淀用70% (体积)乙醇洗涤1次后真空干燥；沉淀用适量含RNA酶 (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCI, ImM EDTA, ρΗ8· 0)(不含 DNA 酶)溶解，37°C作用 30 分钟。本实施方式步骤三中提取的重组质粒进行PCR鉴定PCR的反应体系为18 μ L反应体系，由下列成分组成成分模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3' 20pmol/L 引物 2 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3 10 X扩增缓冲液 2.5mM mmol/L dNTP 混合液 5υ/μ1 U Taq DNA 聚合酶 ddH204用量Ιμ Ιμ Ιμ 2.5μL Ιμ 0.5|iL ΙΙμ PCR 条件为94°C预变性 5min，94°C变性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。重组质粒进行单酶切鉴定PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行Hind III单酶切，酶切体系如下重组质粒2μ1HindlllΙμ IOXMBuffer2μ1ddH20补至终体积为15μ1重组质粒进行序列测定测序工作交由上海美吉生物医药科技有限公司完成。含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体pl8-kan±中kan抗性及两端酶切位点测序结果如下可见同原始序列中沈 1619bp部分相同(原始序列参见pUG6质粒的全长编码序列，见SEQ ID No. 1)，没有变化；测序结果显示loxP-karf-loxP片段以两个不同方向成功连入质粒中，含有loxP-karf- οχΡ片段的jI组质粒载体Pl8-kan±构建成功。GTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含有ｌｏｘＰ－ｋａｎｒ－ｌｏｘＰ片段的重组质粒载体ｐ１８－ｋａｎ±的构建方法，其特征在于含有ｌｏｘＰ－ｋａｎｒ－ｌｏｘＰ片段的重组质粒载体ｐ１８－ｋａｎ±的构建方法按以下步骤进行：一、采用ＰＣＲ技术从ｐＵＧ６质粒中获得ｌｏｘＰ－ｋａｎｒ－ｌｏｘＰ片段；二、胶回收１．６Ｋｂ的ｌｏｘＰ－ｋａｎｒ－ｌｏｘＰ片段，然后以２．７Ｋｂ的ｐＭＤ１８－Ｔ载体作为骨架，通过Ｔ－Ａ末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的ＬＢ固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的ＬＢ液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有ｌｏｘＰ－ｋａｎｒ－ｌｏｘＰ片段的重组质粒载体ｐ１８－ｋａｎ±的构建。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：原韬，沙长青，谷军，张晓彦，陈兵，赵晓龙，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：93
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