一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征是：采用多肽合成的方法生产一种小分子配基，将该小分子配基交联到琼脂糖凝胶上而制得用于纯化免疫蛋白的小分子配基亲和层析凝胶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程下游领域，抗体分离纯化的亲和凝胶介质的生产。
技术介绍
目前世界上最通用的抗体纯化介质为ftOtein A、Protein GJroteinL凝胶介质， 该三种介质都具有自己的特点，如ftOteinA凝胶对人，兔，小鼠的IgG具有较高的亲和吸附。ftOteinG凝胶对山羊IgG具有较高的亲和吸附，ProteinL凝胶对IgY具有较高的亲和吸附。因而针对要做的实验或者生产所需要抗体不同，则要选定不同的凝胶。而该小分子配基同时具有对各种抗体都具有很强的亲和吸附性。只需要采用不同条件，就可以同时吸附不同的免疫蛋白。对生产过程中的原料采购带来了简化方式。并且ftOtein A.Protein G.Protein L凝胶介质都具有共同的缺陷(DftOtein A、Protein G、Protein L都是生物大分子，因而他们都对人体具有过敏反应，所以用这三种凝胶介质纯化抗体后，都必须除去残留。0)Pr0tein A.Protein G.Protein L因为是生物大分子，所以必须通过发酵法进行生产，其生产成本高，纯化难度大。(3)Pr0tein A与IgG的Fc片段发生特异性的吸附，可以由于其结合能力过高，往往再洗脱的时候会出现将IgG的Fc片段拉扯出来的现象，从而破坏了蛋白的空间构象，导致抗体蛋白失去活性。Protein G.Prote in L同样也会出现类似的情况。由于很多抗体蛋白的价格极其高昂，因而这样的现象会导致巨大的亏损与浪费。 (4)抗体作为一种注射用药，因而再生产中要经常做灭菌处理，工业中介质灭菌(包括去除内毒素)常用的方式是采用一定浓度的NaOH溶液清洗管道和凝胶。而ftOtein A.Protein G、Protein L作为生物大分子，不耐受高浓度的碱性溶液，因而在使用过几十个循环后，凝胶就会失活，导致吸附载量急剧下降。因而需要定期更换凝胶，进而增大纯化成本。而本专利技术的小分子配基可以非常好的解决以上四种缺陷(1)该小分子配基是生物小分子，首先不会对人体产生过敏反应，其次，其没有毒性，因而在抗体纯化后，将该小分子配基去除残留很简单。(2)该小分子配基采用多肽合成的方法生产，不仅生产纯化简单，并且更加易于质量的管理与控制。(3)该小分子配基的洗脱条件非常温和，不会出现洗脱时对抗体蛋白的构象产生破坏的现象。(4)该小分子配基分子量小，相对于蛋白更加稳定，能够耐受碱性条件。因而使用周期更长。更节省成本。因而本专利技术的小分子配基凝胶具有更优秀的理化性质，更广泛的抗体亲和吸附能力，生产更为简单，成本更加低廉。
技术实现思路
(1)该小分配基的氨基酸序列为(RTY)4K2KG。按照旋光度不同分为左旋 (L-RTY) 4K2KG 和右旋(D-RTY) 4K2KG 两种。(2)多肽合成方式用于多肽合成原料Fmoc-Gly-wangresin保护氨基酸Fmoc_Lys (Fmoc)-0H，Fmoc-tyr(otbu) -OH, Fmoc-thr(tbu)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH.有机溶剂DMF( 二甲基甲酰胺)哌啶，甲醇，乙醚，三氟乙酸。其它试剂Η0ΒΤ，DIC.⑶合成方法Fmoc-Gly-wang resin 1 克用 10 毫升 DMF 溶胀 40 分钟溶胀后的上述树脂洗涤三次树脂加入10毫升含20%的哌啶DMF溶液作用20分钟，脱掉FMoc保护基团。加入1倍量的Fmoc-Lys(FMoc)-OHjn 1倍量的H0BT，DIC，以及10毫升的DMF，反应45分钟。反应后用茚三酮检验连接效率。连接其它氨基酸重复2-4，不过氨基酸依次使用Fmoc-Lys (fmoc) -0H, Fmoc-tyr (otbu) -OH, Fmoc-thr (tbu) -OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH,反应完毕，得到连接在树脂上的多肽分子。反应后的多肽树脂用甲醇清洗，冻干，准备切割实验。冻干好了后的树脂，用95% TFA DCM溶剂浸泡1小时，树脂上的多肽从树脂上切掉，进入TFA中。上述溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀为所需多肽。多肽通过质谱鉴定，然后通过HPLC纯化，得到纯度大于98 %的产品，即为左旋 (L-RTY) 4K2KG。 若上述氨基酸中的 Fmoc-tyr (otbu) -OH, Fmoc-thr (tbu) -OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH全部更换为右旋氨基酸，即 Rnoc-D-tyr (otbu) -OH, Fmoc-D-thr (tbu) -OH, Fmoc-D-Arg (pbf) -OH, 则为右旋(D-RTY) 4K2KG。(4)小分子配基和凝胶介质交联10毫克多台溶解到碳酸钠缓冲液中，缓冲液pH为7. 5-8. 0.浓度为2毫克每毫升。取用活化好的琼脂糖凝胶6B (采用的产品型号为Genarose-eB) 1毫升上述两者混合反应2-3小时，中间用HPLC监控反应进程，反应完毕后，用碳酸钠缓冲液30毫升洗涤凝胶，得到连接有该小分子配基的琼脂糖凝胶介质。权利要求1.一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用。其特征在于(1)提供一种用于和 IgA, IgE, IgM, IgG IgY都能结合的小分子配基多肽的合成，以及通过把这种配基结合到凝胶介质上形成一种用于纯化抗体的新型亲和纯化介质。( 该小分配基的氨基酸序列为 (RTY) 4K2KG。按照旋光度不同，分为左旋(L-RTY)4K2KG和右旋(D-RTY) 4K2KG。2.如权利要求1所述的一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征在于 该小分子配基兼有ftOteinA，PtoteinG, ProteinL的亲和特性，能够和不同物种的免疫抗体发生亲和作用。只需要采用不同的条件，就可以吸附不同的免疫蛋白，并且具有很优秀的亲和性。3.如权利要求1所述的一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征在于 该小分子配基采用多肽合成方法生产。采用左旋的氨基酸原料合成可的左旋(L-RTY)4K2KG, 若采用右旋的氨基酸原来合成，即得到右旋(D-RTY)4K2KG。这两者在亲和特性上完全一样， 只是由于右旋(D-RTY)4K2KG是采用右旋氨基酸合成得到，因此不容易被酶识别，更耐受酶的作用，降解时间要比左旋(L-RTY)4K2KG长三至四倍。4.如权利要求1所述的一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征在于 该小分在配基在人体内不会产生过敏反应，该分子的毒性试验表明，即使大量的该分子，也不会造成机体毒性。对动物的实验结果为LD50 = 500至2000mg/kg。5.如权利要求1所述的一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征在于 该小分子配基的洗脱条件非常温和，在特定条件下，可以轻易的将目标抗体洗脱下来。6.如权利要求1所述的一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征在于 该小分子配基的结构简单，即使是不同厂商进行生产，都可以通过质谱检验和HPLC检验， 确保结构完全一致。因此在使用该小分子配基生产的凝胶基本上任何厂家的凝胶的安全性是可以统一保证的。(不同厂商，不同工艺代入的杂质另行考虑)。全文摘要本专利技术提供一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用，其特征是采本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种小分子配基亲和层析凝胶的制备及其应用。其特征在于：（１）提供一种用于和ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＧ　ＩｇＹ都能结合的小分子配基多肽的合成，以及通过把这种配基结合到凝胶介质上形成一种用于纯化抗体的新型亲和纯化介质。（２）该小分配基的氨基酸序列为：（ＲＴＹ）４Ｋ２ＫＧ。按照旋光度不同，分为左旋（Ｌ－ＲＴＹ）４Ｋ２ＫＧ和右旋（Ｄ－ＲＴＹ）４Ｋ２ＫＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高再兴，
申请(专利权)人：高再兴，
类型：发明
国别省市：87