一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及纳米材料领域，具体说是一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法。将锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒投加于待分离溶液中，并于磁力作用下，锌离子修饰的纳米颗粒中锌离子螯合待分离溶液中组氨酸标签蛋白，即可吸附分离出待分离溶液中的组氨酸标签蛋白质。本发明专利技术方法通过简单、廉价的方法实现了颗粒修饰，通过简便、快速的方法实现了组氨酸标签蛋白的选择性分离纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米材料领域，具体说是一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签 蛋白质的方法。
技术介绍
生物工程，是20世纪70年代初开始兴起的一门新兴的综合性应用学科，90年代 诞生了基于系统论的生物工程，从生物技术的角度定义生物工程就是应用生命科学及工程 学的原理，借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物 技术，包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等。信息技术的发展改变了人类的生活方 式，而生物工程的突破将帮助人类延年益寿。例如，许多活性蛋白的生产是从生物组织中提 取的，受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。而微生物生长迅速，容易控制，适于 大规模工业化生产。若将生物合成相应蛋白成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相 应的蛋白，不但能解决产量问题，还能降低生产成本。在生物合成过程中，为目的蛋白引入 合适的亲和层析纯化标签，不仅不会影响蛋白的生物活性，而且可以大大简化纯化步骤。作 为目前最常用的一种蛋白标签，组氨酸标签具有多种优点只有6个组氨酸，分子量很小， 一般不需要用酶切去除；可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持 结合力；无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析；可以方便的用 固定金属离子亲禾口色谱(Immobilized Metal-ionaff inity chromatography, I MAC)纯化。IMAC是Porath et al. 1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、 钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。1987年Smith et al.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-s印hadex G-25作用力更 强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-Si5phadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸 和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多 肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸 标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表 达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能 的有力手段。目前的IMAC柱层析技术虽然有这么多的优点，但是它仍然具有传统色谱层析技 术共有的缺点，即不能直接处理发酵液或细胞破碎勻浆液，因为原料液中的固体颗粒会堵 塞层析柱，必须预先采用高速离心或微滤方法除去细胞或细胞碎片。这种分离模式分离时 间长，成本高，而且在固体颗粒的分离中往往会有一定的活性损失。另外，传统层析是将事 先制备好的颗粒状介质填充在层析柱中进行分离纯化的。由于颗粒粒的不均勻性和颗粒内 外的扩散阻力，导致洗脱峰峰展宽，分离效率下降。层析分离效率或理论塔板高度与流动相 流速关系很大，存在一个流速极值点(这个流速实际很低)、高于这个流速时，理论塔板高 度增大，分离效率下降。而且由于颗粒内扩散导致蛋白质实际动态吸附容量很低。近年来，生物技术的迅速发展对目标产品的分离纯化技术提出了更新和更高的要求。除了层析床柱 的设计之外，新型吸附介质的开发和制备也成为蛋白质分离中一个关键的研究领域。传统 的多孔吸附介质面对蛋白质等大分子的分离表现出了诸多的不足。例如，分离过程生物大 分子特别是细胞碎片对吸附载体的相互作用很容易引起分离时间的延长甚至是柱堵塞；吸 附载体孔径的增大缩短分离时间的同时又会导致分离效率的降低；减小吸附介质尺寸增大 了分离效率但是又带来了吸附介质难分离的问题。在由此可见，如何制备选择性高、扩散阻 力小、表面积大而且又方便回收再生的吸附介质成为目前蛋白质分离中需要研究的问题。20世纪80年代，随着扫描隧道显微镜(STM)、原子力显微镜(AFM)等微观表征和 操纵技术的诞生与发展，纳米技术应运而生。其中，纳米颗粒作为一种新型的生物分离介 质，具有较大的比表面积，同时又避免了常规网状分离介质内部扩散阻力的限制，在蛋白质 分离中体现了很好的应用潜力。磁性纳米颗粒基于其独特的磁响应特性、较大的比表面积 和较好的生化活性，为生物分离带来了一种全新的纳米介质。当磁性纳米颗粒表面修饰上 抗体、寡核苷酸等生物探针，就可以迅速靶向结合目标物，在外加磁场作用下，可以很方便 的将磁性纳米颗粒从底液中分离出来，大大缩短了样品的分析时间，这一新颖的分离方法 克服了传统分离方法的不足，使分离效率大大提高，同时磁性纳米颗粒应用于生化分析工 作中，还能使样品的痕量组分最大限度地富集起来，使分离和富集过程同步进行，非常适用 于样品中痕量组分的检测，尤其对于大批量样品的分离检测，磁性纳米颗粒更是表现出优 越。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为将锌离子修饰的超顺 磁性纳米颗粒投加于待分离溶液中，并于磁力作用下，锌离子修饰的纳米颗粒中锌离子螯 合待分离溶液中组氨酸标签蛋白，即可吸附分离出待分离溶液中的组氨酸标签蛋白质。所述锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒将每毫升0. 5-lmM硫酸锌水溶液中加入 10-20mg超顺磁性纳米颗粒中超声分散5-lOmin而后室温下振荡30-60min，即得到锌离子 修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒，待用。所述锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒作用于待分离溶 液是将上述所得3-5mg锌离子修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒加入到0. 5-lml待分离溶液中于 室温下振荡30-60min，并于磁力作用下进行分离待分离溶液。所述锌离子修饰的纳米颗粒 中锌离子螯合待分离溶液中组氨酸标签蛋白，将螯合有组氨酸标签蛋白的纳米粒子加入到 每升PBS缓冲液中含有500mM的咪唑溶液内于室温下振荡10-30min，即将组氨酸标签蛋白 质从纳米颗粒上解离下来，而后再在磁力作用下将纳米颗粒分离出。本专利技术所具有的优点与传统的分离技术相比较，该方法将分离和富集结合于一 体，利用超顺磁性硅壳纳米颗粒较大的比表面，提高了分离过程中颗粒与蛋白质分子间的 作用速度；利用颗粒的超顺磁性，降低了分离过程的操作强度；利用颗粒表面的硅壳材料 对锌离子的吸附作用，实现了颗粒表面的锌离子修饰；利用锌离子与组氨酸之间的螯合作 用，实现了对组氨酸标签蛋白的选择性结合；利用咪唑与组氨酸之间对锌离子螯合的竞争 作用，实现了颗粒结合组氨酸标签蛋白的洗脱。本专利技术方法通过简单、廉价的方法实现了颗粒修饰，通过简便、快速的方法实现了组氨酸标签蛋白的选择性分离纯化。 附图说明图1为本专利技术实施例锌离子修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒透射电镜照片(其中Bar =IOOnm)。图2为本专利技术实施例锌离子修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒对组氨酸标签别藻蓝蛋 白α、β亚基分离电泳佐证图(其中电泳中各泳道分别为1、解离所得蛋白，2、Marker，3、 菌体破碎液，4、磁分离上清)。图3为本专利技术实施例锌离子修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒对组氨酸标签别藻蓝蛋 白α、β亚基分离电泳Western blotting分析图(其中电泳中各泳道分别为1、解离所得 蛋白，2、Marker，3、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法，其特征在于：将锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒投加于待分离溶液中，并于磁力作用下，锌离子修饰的纳米颗粒中锌离子螯合待分离溶液中组氨酸标签蛋白，即可吸附分离出待分离溶液中的组氨酸标签蛋白质。

【技术特征摘要】
一种采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法，其特征在于将锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒投加于待分离溶液中，并于磁力作用下，锌离子修饰的纳米颗粒中锌离子螯合待分离溶液中组氨酸标签蛋白，即可吸附分离出待分离溶液中的组氨酸标签蛋白质。2.按权利要求1所述的采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨酸标签蛋白质的方法，其特 征在于所述锌离子修饰的超顺磁性纳米颗粒将每毫升0. 5-lmM硫酸锌水溶液中加入 10-20mg超顺磁性纳米颗粒中超声分散5-lOmin而后室温下振荡30-60min，即得到锌离子 修饰超顺磁性硅壳纳米颗粒，待用。3.按权利要求1所述的采用超顺磁性纳米颗粒分离组氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈英杰，秦松，崔玉琳，郭雪洁，姜鹏，陈华新，李富超，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]