一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法技术

本发明专利技术属基因工程重组蛋白纯化技术领域，涉及一种纯化重组蛋白的方法，其包括：1)发酵液离心获取上清液、上清液超滤浓缩；2)将超滤后的浓缩液进凝胶过滤层析，除去色素和盐；3)将所得液体经阴离子层析，用高盐梯度洗脱，收集目标蛋白峰；4)收集液经疏水层析获得纯度重组人载脂蛋白ApoA-I。采用本方法纯化重组人载脂蛋白Apoa-I，发酵上清液经超滤浓缩，进一步采取采用凝胶层析和疏水层析即可，最终的洗脱液为水，不必脱盐，直接冷冻干燥，获得的重组人ApoA-I纯度超过96％，回收率高于82％，每次处理量3L，本方法简单方便，工艺稳定，易于放大，能解决工业化生产重组人载脂蛋白ApoA-I的规模问题，适于生产的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属基因工程重组蛋白纯化
，涉及一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，具体涉及一种基于凝胶层析和疏水层析技术规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法。
技术介绍
：现有技术公开了载脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-I,简称ApoA-I)是组成高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白,研究显示，HDL可接受肝外组织细胞流出的胆固醇将其带回肝脏，并通过其的ApoA-I与肝细胞表面受体识别途径，将胆固醇酯释放入肝细胞，实现胆固醇从肝外细胞逆转运回肝脏。ApoA-I约占HDL总蛋白的70％，分子量为28331Da，由243个氨基酸残基组成，其中44～243氨基酸残基组成了8个含22残基和2个含11残基的亲脂性强的α螺旋结构。ApoA-I具有稳定HDL结构与识别、结合SR-BI等HDL受体的作用。实践中可用于抗动脉粥样硬化和肝靶向给药的载体载脂蛋白A(ApoA)。目前用于研究的ApoAⅠ蛋白多为人血清提取获得，但实际中，由于血源短缺以及血制品容易污染等问题则明显限制了其的开发和应用。基因工程技术的产生使得利用基因工程获取ApoA-I成为可能。近年来毕氏酵母表达系统显示出了诸多优势，据资料显示，若干外源蛋白在采用该系统进行表达。本申请的课题组之前利用毕赤酵母表达系统成功高表达了重组ApoAⅠ，其中，采用的纯化方法是先采用冷丙酮-等电点分级沉淀法获取粗品，再应用Q-Sepharose离子交换柱层析，可获得纯度为95％的重组人ApoAⅠ；但该方法中存在有明显的缺陷，尽管看似采用步骤少，但冷丙酮的步骤中则较繁琐，由于ApoAI为分泌表达，发酵液体积大，需要用大量丙酮，沉淀需要低温高速离心，耗能大，因此，该方法不利于规模化纯化。鉴于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，使达到操作简单、工艺稳定、易于放大、适于工业化生产重组人载脂蛋白ApoA-I的分离纯化。
技术实现思路
：本专利技术的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，具体涉及一种基于凝胶层析和疏水层析技术规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法。本方法中，发酵上清液经超滤浓缩，进一步采取采用凝胶层析和疏水层析即可，最终的洗脱液为水，不必脱盐，直接冷冻干燥，简单方便，处理量每次可3L。本专利技术提供了一种操作简单、工艺稳定、易于放大、适于工业化生产的重组人载脂蛋白ApoA-I的分离纯化方法。具体而言，本专利技术的一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，其特征在于，其包括步骤：(1)将毕赤酵母工程菌发酵，对样品的上清超滤，浓缩，脱色；(2)对上述收集液进行阴离子交换层析，初步纯化ApoA-I；(3)对上所述收集液进行疏水层析纯化，进一步纯化ApoA-I。本专利技术步骤(1)中，上清超滤截留分子量为10K，浓缩为原体积的1/10；本专利技术步骤(1)中，对所述超滤后的浓缩液凝胶柱脱色，BestdexG-25凝胶填料装入50/30层析柱，用pH6.0～7.5的20mM不同磷酸盐缓冲液平衡，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；用B泵加入浓缩液，用pH6.0～7.5的20mM不同磷酸盐缓冲液洗脱，收集盐峰前的紫外吸收峰；本专利技术步骤(1)中，采用基因工程大肠杆菌、酵母和细胞培养液为样品；本专利技术步骤(2)中，对上述收集液进行阴离子交换层析，其包括：a，QSepharoseFastFlow阴离子交换填料装入16/20层析柱，用1MNaCl溶液(AKATAExplore蛋白纯化仪的B泵)冲洗2个柱体积以上，流速为90cm/h；b，用20mM不同pH(6.5或7.4)磷酸盐缓冲液(AKATAExplore蛋白纯化仪的A泵)平衡2个柱体积以上，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；C，将上述所得收集液加入平衡后的层析柱,清洗，洗去留在柱子中未结合的蛋白，清洗至UV回到基线；采用梯度或分步洗脱方式洗脱，其中，梯度洗脱的方式：15个柱体积内0％-100％B泵(B泵为1MNaCl溶液)，收集各洗脱峰；分步洗脱方式：清洗后用150mMNaCl溶液洗脱目标蛋白以及部分与目标蛋白结合能力相同的杂蛋白，收集洗脱峰然后用1MNaCl溶液洗脱杂蛋白；本专利技术步骤(3)中，对上述收集液进行疏水层析纯化，其包括：a将PhenylSepharoseFastFlow装入16/20层析柱，用1MNaCl溶液(AKATAExplore蛋白纯化仪的B泵)平衡2个柱体积以上，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；b将经过QSepharoseFF阴离子交换填料初步纯化的ApoA-I与2MNaCl溶液等比例混合，得到1MNaCl待上样溶液；c用B泵上样，流速为90cm/h；d清洗，用1MNaCl溶液清洗至UV基线稳定；e洗脱，梯度洗脱：15个柱体积内100％-0％B泵(B泵为1MNaCl溶液；A泵为20mM磷酸盐缓冲液或纯水)，收集洗脱峰。采用本专利技术方法进行纯化重组人载脂蛋白Apoa-I实验，结果显示，经两步纯化，获得的重组人ApoA-I纯度超过96％，回收率高于82％，每次处理量3L，本方法的优点有：发酵上清液经超滤浓缩，进一步采取采用凝胶层析和疏水层析即可，最终的洗脱液为水，不必脱盐，直接冷冻干燥，简单方便。本专利技术提供了一种操作简单、工艺稳定、易于放大、能解决生产规模问题，适于工业化生产重组人载脂蛋白ApoA-I的分离纯化。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1重组人载脂蛋白A-I纯化步骤示意图。图2SDS-PAGE分析发酵液、浓缩液结果。图3G25层析去除色素结果。图4阴离子交换数据曲线及对应的SDS-PAGE分析结果。图5疏水层析的数据曲线及对应SDS-PAGE分析结果。图6westernblot分析结果。具体实施方式实施例11)发酵上清液超滤浓缩、脱色将毕赤酵母工程菌发酵液离心4000rpm，10min，收集上清液；将上清液使用超滤膜截留分子量为10K，进行超滤浓缩，约浓缩为原体积的1/10；BestdexG-25凝胶填料装入50/30层析柱，用20mM不同pH(6.5或7.4)磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积(AKATAExplore蛋白纯化仪的A泵)，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；用B泵吸入BestdexG-25凝胶填料体积的30％的发酵浓缩液，即90mL的浓缩液，加样结束后，用20mM不同pH(6.5或7.4)磷酸盐缓冲液冲洗，收集盐峰前的紫外吸收峰；2)QSepharoseFF阴离子交换填料初步纯化ApoA-I(1)20mLQSepharoseFastFlow阴离子交换填料装入16/20层析柱，用1MNaCl溶液(AKATAExplore蛋白纯化仪的B泵)冲洗2个柱体积以上，流速为90cm/h；(2)用20mM不同pH(6.5或7.4)磷酸盐缓冲液(AKATAExplore蛋白纯化仪的A泵)平衡2个柱体积以上，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa‑I的方法，其特征在于，其包括步骤：(1)将毕赤酵母工程菌发酵，对样品的上清超滤，浓缩，脱色；(2)对上述收集液进行阴离子交换层析，初步纯化ApoA‑I；(3)对上所述收集液进行疏水层析纯化，进一步纯化ApoA‑I。

【技术特征摘要】
1.一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，其特征在于，其包括步骤：(1)将毕赤酵母工程菌发酵，对样品的上清超滤，浓缩，脱色；(2)对上述收集液进行阴离子交换层析，初步纯化ApoA-I；(3)对上所述收集液进行疏水层析纯化，进一步纯化ApoA-I。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，上清超滤截留分子量为10K，浓缩为原体积的1/10。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，对所述超滤后的浓缩液凝胶柱脱色，BestdexG-25凝胶填料装入50/30层析柱，用pH6.0～7.5的20mM不同磷酸盐缓冲液平衡，流速为90cm/h，平衡至UV基线稳定；用B泵加入浓缩液，用pH6.0～7.5的20mM不同磷酸盐缓冲液洗脱，收集盐峰前的紫外吸收峰。4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，采用基因工程大肠杆菌、酵母和细胞培养液为样品。5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，对所述收集液进行阴离子交换层析，其包括：a，QSepharoseFastFlow阴离子交换填料装入16/20层析柱，用1MNaCl溶液，AKATAExplore蛋白纯化仪的B泵，冲洗2个柱体积以上，流速为90cm/h；b，用20mMpH6.5或7.4磷酸盐缓冲液，AKATAEx...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯美卿，胡祥祥，韩磊，王鑫，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31