一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，属于生物发酵技术领域。本发明专利技术的丙酮丁醇梭杆菌菌株分类命名为ClostridiumacetobutylicumBD518，其保藏登记号为CCTCCNO：M2010308。本发明专利技术通过连续培养驯化筛选得到一株高浓度丁醇耐受性菌株BD518，其丁醇耐受性达到了18g/L，比出发菌株（13g/L）提高了38.5%；以葡萄糖为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂和丁醇产量分别达到21.1g/L和13.2g/L，分别比出发菌株提高了16.6%和15.8%；其丁醇耐受性强，溶剂产量高，重复性好，具有重大的社会意义和经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，具体是通过连续培养装置连续培养驯化选育得到的耐高浓度丁醇量和高溶剂产量的丙酮丁醇梭杆菌菌株，以及该菌株发酵丁醇工业中的应用，属于生物发酵

技术介绍
作为燃料，丁醇具有能量密度大，对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。丁醇又是重要的有机化工原料，广泛应用于油漆、表面涂料、皮革处理、塑料等领域。丁醇的生产方法主要有乙醛缩合法，丙烯羰基合成法和发酵法。乙醛缩合法工艺流程长，收率低，成本较高，目前在国外已被淘汰；丙烯羰基合成法生产丁醇的原料为石化 下游产品丙烯；随着石油价格飞涨和资源加速枯竭，发酵法生产丁醇受到了广泛的重视，逐渐成为生物能源的研究热点之一。近年来，国内对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工程改造、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。丙酮丁醇工业发酵中溶剂对微生物细胞的毒性，是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所生产的丁醇、丙酮和乙醇三种溶剂中，丁醇是毒性最大的。当其浓度达到13 g/L (Journal of Proteome Research2010, 9:3046 3061),利用梭菌C. acetobutylicum发酵就基本停止,造成低丁醇产量和低底物转化率。据分析，如果丁醇发酵的产物浓度由12 g/L提高的19 g/L，产物分离的后续蒸馏成本将可降低一半(Curr Opin Biotechnol, 2008，19(5) : 420 429)。现有技术报道 Cbeijerinckii BAlOl在MP2培养基以及发酵调控条件下的丁醇产物浓度可达到20. 9 g/L(总溶剂为32. 6 g/L)，是目前报道的产溶剂最高的菌株。为了提高产溶剂梭菌本身的丁醇耐受性，Tomas 等(Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4951 4965)在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白的#0万51基因，使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了 85%，并最终使产物浓度提高了 33%。Borden 等(Appl Environ Microbiol, 2007, 73(9): 3061 3068)在丙酮丁醇梭菌中过表达来源于基因组DNA文库中筛选过程中确定的2个与丁醇耐受性相关的基因，即可使重组菌体细胞的丁醇耐受水平分别提高了 13%和81%。中科院微生物研究院毛绍明等(Journal of Proteome Research2010, 9: 3046 3061)利用原生质体的方法以CZo1Striacetobutylicum DSM 1731为出发菌株筛选出一株能够耐受19 g/L 丁醇的突变株Rh8，通过发酵调控手段，单批发酵总溶剂产量为19.2 g/L。可见，提高菌株的丁醇的耐受性是提高丙酮丁醇产量的重要手段之一，在丙酮-丁醇发酵工业中，起着至关重要的作用，而利用连续培养驯化菌种是提高丁醇耐受性，增强发酵竞争力的关键手段之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一在于提供一株耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌{Clostridium aceteto),使其相对于现有技术的产丁醇的丙酮丁醇梭菌而言具有丁醇耐受性极强、总溶剂产量极高的优势。本专利技术要解决的技术问题之二在于提供所述耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌{Clostridium acetobutylicum)的应用方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一、本专利技术选育得到的一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，分类命名为acetobutylicum BD 518，其保藏登记号为 CCTCC NO M 2010308。本专利技术所述的高丁醇耐受丙酮丁醇梭菌ace tobu tyli cum BD 518的筛选方法是将丙酮丁醇梭菌出发菌株ace tobu tyli cum XY16 (CCTCC NO:M 2010011)经连续培养驯化后，利用丁醇平板筛选得到丁醇耐受强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁醇比高和总溶剂产量高的丙酮丁醇梭菌目标菌株，即命名为acetobutylicum BD 518。其具体的筛选步骤如下a)连续培养驯化诱变将丙酮丁醇梭菌原始菌株CViostrit/iwffi acetobutylicumXY16 (CCTCC NO M 2010011)活化培养，即培养温度33 37°C，在25 mL的肖特厌氧瓶装液量为10 15 mL，培养时间12 18 h，得到处于对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制连续培养装置中连续培养，接种量为5% 15%(v/v)。以葡萄糖为限制因子，在培养基中加入10 30mL/L正丁醇驯化600 1000 h，初步筛选到耐丁醇的丙酮丁醇梭菌菌株;b) 丁醇平板初筛将连续培养装置(本专利技术人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A)中驯化筛选得到的菌液稀释至OD6tltl=O. I I. 0涂布于含丁醇I. 7%的培养基平板上，33 37°C厌氧培养12 36 h，挑选出10 50株单菌落；c) 丁醇平板复筛将步骤b)筛选的菌株接种于25 mL的肖特厌氧瓶装液量10mL，充氮气2 min，33 37°C厌氧培养10 14 h，无菌生理盐水制成浓度OD=O. I的菌悬液，吸取2 UL点滴到含有丁醇I. 7%的常规固体培养基平板上，在33 37°C温度下厌氧培养12 24 h，挑选菌落较大的菌株；d)厌氧瓶发酵筛选将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33 37°C，厌氧培养培养时间10 24 h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5% 15% (v/V)，发酵温度33 37°C，厌氧发酵发酵时间60 80 h ;考察步骤c)筛选出的菌落发酵产总溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出丁醇比和总溶剂产量最高的目标菌株，即命名为Clostridium acetobu tylicum BD 518。在上述筛选方法中步骤a)中所述的连续培养驯化方法中，优选限制因子葡萄糖浓度为10 30g/L，驯化时间为600 IOOOh0在上述筛选方法中步骤b)和c)所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。在上述筛选方法中步骤d)所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖中的一种或几种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素BI、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。二、本专利技术所述的ace tobu tyli cum BD 518在发酵生产丁醇中的应用。具体的，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤I)平板培养将丙酮丁醇梭菌BD 518接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33 37°C，培养时间12 24 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，其分类命名为Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ　ＢＤ　５１８，其保藏登记号为ＣＣＴＣＣ　ＮＯ：Ｍ　２０１０３０８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，贺爱永，郭亭，杜腾飞，陈可泉，吴昊，韦萍，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84