一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法，包括（1）种子的活化：将丁醇发酵菌接入RCM培养基中活化制备种子液；（2）淀粉的液化：将淀粉调至干物质浓度为5wt%-10wt%，调节pH值为6.0-6.5，加入淀粉液化酶，加热至60-95℃进行液化；（3）制备P2培养基：以液化淀粉为原液配制P2培养基；（4）同步糖化发酵：对灭菌后的淀粉P2培养基除氧后，接入步骤（1）活化的丁醇发酵菌种子液，同时加入淀粉糖化酶，进行厌氧发酵生产丁醇。本发明专利技术方法不仅避免了葡萄糖累积对糖化酶产生的抑制作用，减少了酶用量，降低了生产成本；而且避免了酶解液中高浓度葡萄糖对发酵菌种初期生长的抑制作用，缩短了发酵周期，提高了总溶剂产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法。
技术介绍
丁醇是一种重要的化工原料，广泛用于各种塑料和橡胶制品的制造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化学品的合成。近年来，随着下游产业的发展，市场需求直线上升，2013年我国丁醇的进口量在40万吨左右；丁醇也是继燃料乙醇后又一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当，蒸汽压低，与汽油任意比混溶，使用安全性能高，并且不产生SOx及NOx等传统化石燃料所产生的环境污染废弃。另外，丁醇不会腐蚀管道、不易吸水，依靠现有的汽油输送管道及分销渠道便可以实现远程输送，基于以上的优良特性，联合国国际能源署将生物丁醇列为第二代生物燃料。微生物发酵产丁醇作为一种重要的生物转化技术极具发展和产业化的潜力，用于微生物发酵的生物质原料，按照传统的划分主要有三类：糖、淀粉和木质纤维素。当前，以淀粉基生物质，如玉米、小麦、木薯等，作为微生物发酵原料的基数最为成熟，市场占有率也最高。因而淀粉作为一种优质的原料被广泛地应用，但是生产成本较高，丁醇的生产率受到一定程度的限制。淀粉及生物质的糖化和发酵可以分步进行，也可以同步进行。分步糖化发酵是指先将淀粉及生物质在淀粉酶和糖化酶的作用下液化糖化，然后利用该糖液进行发酵。Thang等（ThangVHetal.ApplBiochemBiotechnol,2010,161:157-170）利用ClostridiumSaccharoperbutylacetonicumN1-4分步糖化发酵玉米淀粉，总溶剂产量为20.7g/L。该法虽然可以使糖化过程和发酵过程在最优的条件下分别进行，但是淀粉水解后的高浓度葡萄糖会抑制糖化酶的活性从而降低酶解效率，进而影响产物得率。同步糖化发酵是指淀粉质原料糖化过程和发酵过程在同一反应器中同步进行，节省了设备投资的同时降低了葡萄糖积累对糖化酶和发酵菌种初期生长的抑制作用。王贤等（甘薯渣同步糖化发酵生产酒精的工艺优化,农业工程学报,2012,28:256-261）在甘薯发酵生产酒精的工艺优化中用到了同步糖化发酵工艺，加入耐高温α-淀粉酶后混匀，置于恒温水浴摇床液化，液化后冷却至30℃，调节pH值，加入硫酸铵，糖化酶，活化后的酵母，静置发酵。该方法需要事先调节同步糖化发酵体系的pH为4，然后开始后续的糖化和发酵。然而由于糖化和发酵的最优条件不同，并且由于菌株自身的特性，该方法仅适用于酵母菌发酵酒精，用于丁醇发酵时，效果不佳。CN103898165A公开了一种淀粉基生物质同步糖化发酵生产乙醇的方法，包括：在糖化釜中利用α-淀粉酶和糖化酶对淀粉基生物质进行糖化；收集酶解后的糖化液；以及在发酵釜中利用酵母菌培养物对糖化液进行发酵得到含有乙醇的发酵液；其特征在于：糖化的同时从糖化釜收集部分糖化液并输送至过滤装置，经过滤后的固相返回至糖化釜，而经过滤后的液相输送至发酵釜，同时将相同体积的发酵液循环返回至糖化釜。该方法只是实现了糖化和发酵在时间上的同步，并非在同一反应器中进行。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法。本专利技术方法不仅避免了葡萄糖累积对糖化酶产生的抑制作用，减少了酶用量，降低了生产成本；而且避免了酶解液中高浓度葡萄糖对发酵菌种初期生长的抑制作用，缩短了发酵周期，提高了总溶剂产量。本专利技术淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法，包括如下内容：（1）种子的活化：将丁醇发酵菌接入RCM培养基中活化制备种子液；（2）淀粉的液化：将淀粉调至干物质浓度为5wt%-10wt%，调节pH值为6.0-6.5，加入淀粉液化酶，加热至60-95℃进行液化；（3）制备P2培养基：以液化淀粉为原液配制P2培养基；（4）同步糖化发酵：对灭菌后的淀粉P2培养基除氧后，接入步骤（1）活化的丁醇发酵菌种子液，同时加入淀粉糖化酶，进行厌氧发酵生产丁醇。本专利技术步骤（1）所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），如可以采用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824，购于美国模式菌种收集中心；或者采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9354。本专利技术优选使用拜氏梭菌CM20，该菌株由于自身的特异性，在该发酵体系中耐受性和适应性更好，丁醇产量更高。本专利技术步骤（1）所述的RCM培养基配方是本领域常规使用的，具体配方（以g/L计）为：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉3.0，葡萄糖5，可溶性淀粉1.0，氯化钠5.0，醋酸钠3.0，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，琼脂0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。本专利技术步骤（1）所述的种子活化是将丁醇发酵菌的孢子液接入RCM培养基中，于36-38℃下厌氧培养16-20h得到种子液。本专利技术步骤（2）所述的淀粉可是玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉等，优选为玉米淀粉。采用纯水将淀粉调至干物质浓度（100g淀粉和水的混合体系中所含干淀粉的质量）为6wt%-8wt%，利用碱液调节体系pH值为6.0-6.5，调节pH值后加入淀粉液化酶，加热至70-90℃，恒温搅拌2-5h。淀粉液化酶为耐高温的α-淀粉酶，加入量为6×10-4-3×10-3g/g淀粉。本专利技术步骤（3）以液化淀粉为原液配制P2培养基，P2培养基的配方是本领域技术人员所熟知的。具体配方（以g/L计）为：酵母粉1，CH3COONH42.2，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MnSO40.01，NaCl0.01，MgSO4·7H2O0.2，FeSO40.01，对氨基苯甲酸0.001，维生素B10.001，生物素0.001e-3，115℃灭菌20min。本专利技术步骤（4）先利用高纯氮气吹扫，再添加除氧剂的方式除氧，除氧剂为1g保险粉与0.6g碳酸钠溶于10mL纯水制得。然后按照体积比5%-10%接入步骤（1）活化的种子液，同时加入淀粉糖化酶，加入量为0.4×10-3-2.0×10-2g/g淀粉。本专利技术步骤（4）发酵生产丁醇的温度为35-38℃，转速为50-200rpm，发酵时间为72-120h。与现有技术相比，本专利技术取得以下有益效果：1、采用本专利技术所述的同步糖化发酵丁醇体系，可以实现了淀粉糖化与菌种发酵同步进行，避免了葡萄糖累积对糖化酶产生的抑制作用，减少了酶用量，降低了生产成本；而且避免了分步糖化发酵过程中水解液中高浓度葡萄糖对发酵菌种初期生长的抑制作用，缩短了发酵周期，提高了总溶剂产率。2、本专利技术同步糖化发酵方法无需对糖化液进行过滤，带渣发酵，玉米淀粉糖化和发酵在同一反应器中进行，不需要调控pH，工艺操作简单，降低了生产强度，提高了溶剂的生产率。生物材料保藏说明本专利技术提供的拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCCN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）种子的活化：将丁醇发酵菌接入RCM培养基中活化制备种子液；（2）淀粉的液化：将淀粉调至干物质浓度为5wt%‑10wt%，调节pH值为6.0‑6.5，加入淀粉液化酶，加热至60‑95℃进行液化；（3）制备P2培养基：以液化淀粉为原液配制P2培养基；（4）同步糖化发酵：对灭菌后的淀粉P2培养基除氧后，接入步骤（1）活化的丁醇发酵菌种子液，同时加入淀粉糖化酶，进行厌氧发酵生产丁醇。

【技术特征摘要】
1.一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）种子的活化：将丁醇发酵菌接入RCM培养基中活化制备种子液；（2）淀粉的液化：将淀粉调至干物质浓度为5wt%-10wt%，调节pH值为6.0-6.5，加入淀粉液化酶，加热至60-95℃进行液化；（3）制备P2培养基：以液化淀粉为原液配制P2培养基；（4）同步糖化发酵：对灭菌后的淀粉P2培养基除氧后，接入步骤（1）活化的丁醇发酵菌种子液，同时加入淀粉糖化酶，进行厌氧发酵生产丁醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的丁醇发酵菌采用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824，购于美国模式菌种收集中心。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的丁醇发酵菌采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9354。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的RCM培养基具体配方（以g/L计）为：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉3.0，葡萄糖5，可溶性淀粉1.0，氯化钠5.0，醋酸钠3.0，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，琼脂0.5，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹长海，张全，佟明友，王领民，乔凯，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11