本发明专利技术涉及PRR11和FAM33A基因双向启动子及其应用。PRR11和FAM33A基因双向启动子在正向或反向两个方向均能驱动基因的转录和表达，在基因工程和基因治疗等领域具有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及PRRll和FAM33A基因双向启动子及其应用。
技术介绍
启动子(Promoter)是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其它转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA序列。启动子在用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物等方面，具有重要的应用价值。双向启动子 (Bidirectional Promoter)，属于一种特殊类别的启动子，该类启动子能够同时驱动其两侧邻近的排列方向相反的两个基因的转录。与传统的单向启动子相比，双向启动子在具体应用时，不仅可以实现单个外源基因的表达，还可以实现两个外源基因的同时表达，因此在用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物等方面具有更为重要的价值。目前，要实现 “采用一个载体同时高效表达两个外源基因”主要有如下三种策略(1)使用一个启动子，通过内部核糖体进入位点序列anternal Ribosome Entry Site, IRES)连接两个外源基因；使用两个独立的单向启动子分别驱动两个外源基因同时表达；C3)使用一个双向启动子同时驱动两个外源基因表达。在生物医学研究和生物
，采用一个载体同时高效表达两个外源基因其有重要和广泛的应用价值。例如同时表达两个功能或结构上相同或不同的外源基因以用于基因治疗等目的；同时表达一个二聚体蛋白质的两个亚基以使其在细胞内组装成有活性的蛋白质；共表达目的基因与报告基因，通过报告基因追踪目的基因的转录及表达；作为多价DNA疫苗的表达载体，以获得对多种抗原良好的免疫应答以及提高核酸疫苗免疫效率。PRRll (Proline-rich protein 11，PRR11)基因是我们实验室最近在恶性肿瘤相关新基因挖掘与筛选研究中发现的一个新的肿瘤相关基因，我们实验室率先在国内外开展该基因的生物学功能和表达调控机制等相关研究。关于该基因的生物学功能，我们的初步研究结果表明，其可能参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生物学过程。PRRll基因的上游紧邻基因为FAM33A (family with sequence similarity 33A)，该基因则是一个最近鉴定的参与细胞增殖和细胞周期的肿瘤相关基因。有趣的是，PRRll基因和其上游紧邻基因FAM33A基因的转录方向恰好相反。在我们的前期研究工作中，我们已经初步鉴定了 PRRll和FAM33A基因的转录起始位点，并对其启动子区域进行了初步分析。在前期工作中， 我们采用PCR定向克隆等技术，构建了多个相互重叠并覆盖PRRll基因转录起始位点附近约2. Okb区域的PRRll和FAM33A基因启动子的荧光素酶报告基因重组体。通过对这些重组体进行启动子活性分析，初步对PRRll和FAM33A基因的启动子区域进行了粗略定位，同时这些结果也提示PRRll和FAM33A基因可能共享一个双向启动子，即PRRll和FAM33A基因之间可能存在一段启动子序列能够双向调节这对基因的转录。本专利技术就是在该前期工作基础之上，对这段可能的双向启动子序列进行了鉴定和分析。通过启动子活性分析，结果表明，在PRRll和FAM33A基因之间，确实存在一段双向启动子序列，即该双向启动子在正向或反向两个方向均能驱动基因的转录，可用于基因工程产品和基因治疗药物的设计和制备等。而且，这段双向启动子序列的大致区域被初步锁定于PRRll和FAM33A基因之间688bp的区域(即SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列)，并通过系列删除体分析，将这段双向启动子序列的核心区域进一步锁定于PRRll和FAM33A基因之间80bp的最小区域内(即SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供PRRll和FAM33A基因双向启动子的序列，以及进一步提供该双向启动子序列在设计和制备基因工程产品和基因治疗药物中的应用。PRRll和FAM33A基因的双向启动子的序列，其特征在于它包括(1)具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核酸序列互补的核酸序列；或(3)与(1)或⑵所述的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或(4)是⑴、⑵或(3)的核酸序列的类似物的核酸序列；或(5)与(1), (2), (3)或(4)的核酸序列，在杂交条件下杂交的核酸序列。上述的任意一种PRRll和FAM33A基因双向启动子的核苷酸序列可用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物。具体地讲，将该启动子下游或上游连接其它外源基因，并与不同的表达载体连接，转化到合适的宿主细胞，使外源基因表达，以制备基因工程产品或基因治疗药物等；或者将该启动子的上游和下游各连接一个外源基因，并与不同的表达载体连接，转化到合适的宿主细胞，使两个外源基因同时表达，以制备基因工程产品或基因治疗药物等。本专利技术中所述的核酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分离序列的人工突变体，它还具有它的启动子功能。还可以是所述的核苷酸序列与其它的启动子序列的融合序列。本专利技术中所述的其它外源基因是指具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能的任何一段核酸序列，包括RNA或DNA序列。在正常情况下，该序列与PRRl 1和FAM33A基因的双向启动子不相互结合。本专利技术中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在合适的宿主细胞中表达的任何一种载体。本专利技术中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入合适的宿主细胞的任何一种方法。本专利技术中所述的宿主细胞是指任何用于基因工程产品制备或基因治疗药物等的接受外源基因的细胞。术语“核酸序列”是指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。附图说明图1为PRRll和FAM33A基因启动子报告基因重组体的构建示意2为各PRRll和FAM33A基因启动子报告基因重组体在H1299细胞中的活性结果图3为各PRRll和FAM33A基因启动子报告基因重组体在HeLa细胞中的活性结果具体实施说明实施例1 :PRR11和FAM33A基因启动子报告基因重组体的构建PRRll和FAM33A基因启动子报告基因重组体的构建参见图1。其中，TSS即转录起始位点CTranscription Start Site，TSS) ；PRRll基因的首个转录起始位点的碱基被定位为+1 ；图中各重组体的命名为“基因名称-P长度(起始位点/终止位点)”，下文中的重组体名称则简写为“基因名-P长度”。1、FAM33A-P688 的构建采用PCR介导的定向克隆的方法。首先使用I^rimer Premier 5. 0软件设计出一对引物，分别含Kpn I/Nhe I限制性酶切位点(PRR11-PF1269-2 5' -CTAGGCTAGCAGGAGGAGGGAACTCGACTCTGG-3‘PRR 11-PR1956-2 5' -GGGGTACCGATTCGCTCTTCGGATGGTGTA-3‘)，以pGUb-PRRll-P1496(100ng/y 1)重组质粒或人正常基因组DNA为模板，采用 Invitrogen公司的高保真酶platinum Taq进行PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＰＲＲ１１和ＦＡＭ３３Ａ 基因的双向启动子，其特征在于它包括：（１）具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２所示的核苷酸序列；或（２）与（１）所述的核酸序列互补的核酸序列；或（３）与（１）或（２）所述的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或（４）是（１）、（２）或（３）的核酸序列的类似物的核酸序列；或（５）与（１）、（２）、（３）或（４）的核酸序列，在杂交条件下杂交的核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卜友泉，艾青，刘竹，杨正梅，宋方洲，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85
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