本发明专利技术利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对禽流感病毒H5N1和H9N2有很强的抑制或杀灭作用。本发明专利技术的结果可应用于制备抗流感病毒药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及 防御素及其在制备抗流感病毒药物中的应用。具体地，涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备抗流感病毒药物中的应用。
技术介绍
防御素的结构特点及分类防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。 防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点(1)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加里福尼亚大学 Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类α防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类α防御素、β防御素和θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6 个保守的半胱氨酸形成了 3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5 防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素——由18个氨基酸残基组成的环状θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即ΗΝΡ1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β -防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β-防御素基因。防御素的表达与病源体的入侵是紧密相关的， 例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。到目前为止，分离到的兔防御素有9个，其中7个为α防御素ΝΡ_1，NP_2，NP_3a， NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素RK_1和RK-2， 产生于兔肾细胞。α _防御素NP-I比人防御素HNP-I的抗菌活性强5 10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质在NP-I分子中含有9个净正电荷，而在HNP-I 分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1, NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-I由33个氨基酸组成，属于α “防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6，2-4，3-5 (Ganz, 1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。禽类是人畜共患疾病病原体的重要传播源。人类病原体，如沙门氏菌和弯曲杆菌属，驻留在鸡肠道内可能不会引起临床症状，但是引起食物中毒的主要原因(Helms et al. ,2006 ；Kessel et al.，2001)。家养禽类也是一个禽流感病毒(Influenza A Virus, IAV)亚型的重要传播源，威胁到动物和人类健康(如H5W)，并涉及到定期在亚洲暴发的流感的再次发生(Kimg etal.，2007)。因此，如果家养禽类的先天性免疫获得提高，那么动物健康和公共健康将大大受益，甚至能阻止人畜共患病原体的增值和蔓延。 家禽先天免疫的提高主要依靠防御素，防御素是一大族具有广谱抗细菌，真菌，原生动物和被膜病毒等微生物活性的阳离子小肽(ZaslOff，2002)。防御素除了直接的抗菌活性外，还具有免疫调节作用，防御素可选择性聚集单核细胞，T淋巴细胞，树突状细胞和肥大细胞趋化到炎症部位以促进适应性免疫(Territo et al.，1989 ；Chertov et al.，1996 ； Yang et al.，1999 ；Niyonsaba et al.，2002)。此外，防御素还能诱导腹腔肥大细胞释放组胺和提高巨噬细胞的吞噬作用(Befus et al.，1999 ；Fleischmann et al.，1985 ；Ichinose et al.，1996)。抗炎症的特性已被归因于防御素，如抑制多核型白细胞甲酰肽受体介导的炎症和结合细菌内毒素(Grutkoski et al. ,2003 ；Motzkus et al.，2006)。此外，防御素可诱导成纤维细胞和上皮细胞的增殖以促进伤口的修复(Murphy et al. , 1993 ；Aarbiou et al.，2002，2004)。在禽流感物种，特别是鸡形目中，发现了几个β-防御素，而在系统发育上较古老的脊椎动物中还未发现存在α防御素和θ防御素，如禽类和鱼类，这暗示所有防御素亚家族一定是从一个祖先β-防御素基因通过重复和多样化进化而来的(Semple et al.，2003)。防御素抗微生物机理在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-I形成瞬时的，人防御素 HNP-I形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。 正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。不同防御素的抗微生物活性由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差另|J。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100 μ g/ml之间(Patterson Delafied et al., 1980,1981 ；Lehrer et al. ,1983,1985a,1985b, 1986,1989 ；Selsted et al.，1984，1985c， 1987,1992 ；Ganz,1985a ；Segal et al. ,1985 ；Daher et al. ,1986 ；Levitz et al.，1986 ； Shafer et al. , 1988 ；Eisenhauer et al. , 1989 ；Yamashita and Saito, 1989 ；Cullor et al. ,1990,1991 ；Miyasaki et al. ,1990a,1990b,1990b ；Borenstein et al.，1991a， 1991b ；本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种短肽ｍＮＰ－１，其氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，陈宇红，尹维波，白丽莉，孙勇如，宋丽英，赵世民，陈凡，储成才，张克臣，曹国治，吴东来，关云涛，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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