本发明专利技术涉及一种预防和/或治疗阿尔茨海默病的疫苗，该疫苗是利用突变型β淀粉样蛋白多肽及其洐生物刺激致敏树突状细胞而获得，通过动物实验证实该疫苗安全、有效。本发明专利技术可用于阿尔茨海默病的预防和/或治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种利用突变型β淀粉样蛋白多肽及其珩生物刺激致敏后的树突状细 胞(Dendritic cell, DC)而获得的阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)疫苗。
技术介绍
AD是一种发病年龄早、发病率高、危害极大的中枢神经系统退行性变。多在60岁 以上发病，其发病率随年龄增高而增高。美国阿尔茨海默病协会根据美国CDC的统计报道， 截止2008年美国AD患者已经达到520万，全球AD患者已经接近3000万。65岁以上老人 中有13%罹患此疾病，平均每71秒就有1名新发病例。而据估计到本世纪中期，全球的AD 患者将达到1亿人，平均每33秒就将会有1名新发病例出现。随着我国人口渐趋老龄化， AD的发病率不断提高，寻找积极有效的预防及治疗措施，对于提高老年人口的生活质量，减 轻家庭及社会的经济和精神负担具有非常重要的意义。AD的特征性病理变化包括由β淀粉样蛋白(Amyloid beta, Αβ)在脑实质中沉 积形成的老年斑(Senil印laqUeS，SP)和神经细胞中高度磷酸化的τ蛋白沉积形成的神经 原纤维缠结。随着淀粉样蛋白学说得到多方面实验证实并获得大多数人认同，人们提出了 针对Αβ的各种AD治疗方案。其中利用抗Αβ抗体进行免疫治疗是促进机体清除已形成 的Αβ的重要手段。许多使用抗Aβ抗体的体内外实验均证实Aβ免疫治疗能够减少Aβ 沉积，提高AD模型鼠学习和记忆功能。Αβ主动免疫治疗，即AD疫苗，以其经济、便捷、作用 维持时间长等优点而受到多数研究人员的青睐。至今AD疫苗最接近成功的是Elan公司的AD疫苗ΑΝ1792。该疫苗由Αβ1_42多 肽和QS-21佐剂构成。该疫苗在II期临床试验中却因300名试验者中有18名患者出现了 非特异性脑膜脑炎的症状而被FDA终止了。尽管该试验失败了，但其中一些接受疫苗接种 的AD患者却表现出良好的效果。其中许多患者血清中出现了高滴度的抗Αβ抗体，其抗血 清能够与脑病理切片中的Αβ沉积物反应。随着随访时间的延长，产生了抗体的患者其认 知功能减退程度显著低于未产生抗体者，且抗体滴度越高，差异越明显。此外，通过对死于 脑膜脑炎并发症患者的尸检发现其脑内Αβ斑块明显少于未接种的AD患者，同时还发现有 小胶质细胞的激活和T细胞向中枢神经系统的浸润。随后对发生脑膜脑炎患者的分析表明 脑膜脑炎的病情与抗体反应的程度以及抗原表位的特异性并无直接关联。而且大多数出现 抗Αβ抗体的患者并没有出现脑膜脑炎。这些情况都提示患者出现脑膜脑炎与针对Aβ的 T细胞自身免疫反应有关，其中包括Αβ反应性ThlT细胞在外周的激活及其向Αβ斑块的 浸润。多数学者认为，对于ΑΝ1792实验中的严重副反应，属于自身免疫发生激活的无菌性 免疫炎症，与疫苗所用QS21佐剂有关。该佐剂以诱导Thl型反应为主，使IFN-γ之类的致 炎因子产生，刺激T细胞产生Αβ反应性细胞毒性T细胞。而保护性抗体的产生需要Th2 型反应激活B淋巴细胞。但Αβ是正常神经元细胞结构蛋白的代谢产物，机体对其存在中枢性免疫耐受。 只有通过添加佐剂等特定手段增强其抗原性才能较稳定地诱导产生抗体，不添加佐剂增强疫苗抗原性就难以保证获得抗体。如何避免佐剂的Thl型反应或是在不使用佐剂的情况下 诱导Th2型反应，从而安全有效地获得A β抗体将是AD疫苗获得成功的关键。许多学者采 用改良的Th2型佐剂、降低疫苗T细胞表位抗原、改变接种途径、制备DNA或RNA疫苗等多 种方法制备不引起Thl型反应的AD疫苗。而本专利技术所采用的方法是利用树突状细胞(DC) 的抗原递呈能力，制备能够引起机体产生足够抗体滴度的AD疫苗。经过我们的初步实验， 证实这一种安全、有效、经济且使用简便的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的基础之一是发现了突变型β淀粉样蛋白免疫原性比野生型β淀粉样蛋 白强。经实验证实不同的突变型β淀粉样蛋白免疫原性有差异(多肽1 8)。从中我们 选取了其中免疫原性较强的人工合成的双突变型多肽(多肽1)进行初步及后续实验。实 验还包括了不同长度多肽免疫原性的研究(多肽9 11).本专利技术的初步实验证实，采用野生型β淀粉样蛋白致敏DC不能诱机体产生抗Αβ 抗体，而采用突变型AB多肽致敏DC则能诱导机体产生高滴度的抗A β抗体。在初步实验的基础上，我们利用突变型β淀粉样蛋白多肽致敏DC，对PDAPP转基 因小鼠进行了实验，采用液相芯片技术检测治疗前后血清及脑脊液中多种炎症因子的变化 情况，证实了采用致敏DC疫苗的方法不会象佐剂疫苗那样引起Thl型炎症反应，从而避免 普通Αβ疫苗导致的脑膜脑炎等严重副反应。通过对转基因小鼠治疗后的行为学及病理学 检查证实本方法所制备的DC疫苗能够改善转基因模型小鼠的认知和记忆能力，能够减少 转基因小鼠脑内的Αβ沉积。具体实施例方式本专利技术从小鼠股骨和胫骨骨髓腔内收获骨髓细胞，用重组珠小鼠白细胞介素 4(以下简称IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(以下简称GM-CSF)各lOng/mL的 DC培养基(加入青霉素和链霉素至终浓度各100U/mL、终浓度0. 33%的0. 1 % 2-巯基乙醇 及终浓度10%胎牛血清的RPMI-1640培养基)进行培养，24小时后弃去培养基及其中未贴 壁的细胞，按原培养基细胞因子浓度重新加入DC培养基。培养72小时后吸弃1/3上清液， 补充已添加相同浓度细胞因子的DC培养基。同时添加选出的突变型AB多肽、野生型AB多 肽至终浓度22. 2μ g/mL共培养以致敏DC，72小时后收获漂浮于培养中的成熟DC，用流式细 胞技术对DC进行检测，成熟度达标后即作为DC疫苗用于免疫接种实验。本专利技术所做初步实验采用C57和BALB/C小鼠，分5组，每组10只，除用分别用突 变型和野生型乙型淀粉样蛋白多肽致敏的DC疫苗外，还包括野生型乙型淀粉样蛋白多肽 +佐剂疫苗(以下简称佐剂疫苗)、单纯无多肽致敏的DC细胞疫苗以及无治疗效果的磷酸 缓冲盐溶液(以下简称PBQ。每只小鼠均腹腔接种0. 2ml液体。其中DC疫苗接种采用 1 X IO5DC细胞悬浮于PBS中进行接种。佐剂疫苗接种采用50 μ g野生型乙型淀粉样蛋白多 肽溶于0. ImlPBS中，并与0. Iml氟氏佐剂混勻、乳化后接种。接种后每7天在小鼠的腮下 静脉丛取血，用ELISA夹心法对抗A β抗体滴度进行检测，直到接种后35天。所得各组平 均抗Aβ抗体滴度变化如附图1所示。后续的实验采用PDAPP转基因小鼠进行。实验分4组，每组12只，分组中因经济因素取消了原初步实验中的野生型Αβ多肽致敏的DC细胞疫苗组，其余同初步实验一致。 接种后每10天在小鼠的腮下静脉丛取血，用ELISA夹心法对抗Αβ抗体滴度进行检测，用 液相芯片检测血清中的多种炎症因子浓度，直到接种后50天。接种60天开始进行Morris 水迷宫实验以检查转基因小鼠的认知和记忆功能。完成行为学实验后麻醉小鼠，取其脑脊 液进行炎症因子检测。放空静脉血后，行心脏灌注再行病理学检查。所得各组平均抗Αβ 抗体滴度变化如附图2所示。各组血清平均炎症因子浓度变化如附图3所示。各组潜伏时 间变化如附图4所示。各组平均穿越平台次数如附图5所示。各组平均目标象限停留时间 如附图6所示。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多肽，该多肽为人工合成的突变型β淀粉样蛋白多肽。
【技术特征摘要】
1 一种多肽，该多肽为人工合成的突变型β淀粉样蛋白多肽。2.根据权利要求1所述多肽，改变其氨基酸长度所获得的新多肽，多肽长度从25个氨 基酸到42个氨基酸不等。3.根据权利要求2所述多肽，改变其氨基酸序列中第21、22、23及第6、7位置氨基酸所 制造的新的突变型β淀粉样蛋白多肽及其组合。4.根据权利要求1、权利要求2以及权利要求3所述多肽，对多肽序列的N末端及C末 端进行化学修饰所获得的化合物。该修饰方式符合如下条件R-(P)-R’。其中P为权利要求1、权利要求2及权利要求3所述的多肽。 R为对该多肽N末端进行化学修饰的基团，这些化学修饰基团包括以下类型 氢； 卤素；小烷基基团，包括8个碳原子以下(含8个)的脂肪...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金环，曹传海，罗仲秋，徐新女，
申请(专利权)人：天津市第一中心医院，
类型：发明
国别省市：12
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