成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法技术

本发明专利技术涉及成骨细胞特异性转录因子－２基因修饰的组织工程化骨的构建方法，属于骨组织工程领域。本方法采用一种天然生物衍生材料（脱细胞骨基质）与种子细胞（成骨细胞特异性转录因子－２基因修饰的骨髓间充质干细胞）复合构建骨组织，经体外动态培养后，进行大段长骨缺损的修复，可实现骨缺损的临床愈合。本发明专利技术适用于骨科、整形、颌面外科等多种常见修复。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，属于骨组织工程

技术介绍
由于肿瘤切除、外伤、骨疾病及骨异常生长所造成的骨缺损，单纯依靠自行修复很难愈合，因此植骨术是治疗大段骨缺损的最有效措施。在美国植骨术已成为仅次于输血的组织移植技术。据美国疾病预防与控制中心不完全统计，在美国每年因骨缺损需要进行骨移植手术的患者超过100万例，医疗费用超过50亿美元，在英国的费用也超过了9亿英镑。传统的移植方式主要有自体骨移植和异体骨移植，但自体骨移植面临着骨源受限、增加创伤和感染率等缺陷，而异体骨移植存在生物活性差、免疫排斥反应和传播疾病的危险。近年来组织工程技术的发展为骨缺损的治疗提供了新思路。骨髓间充质干细胞(MSCs)因具有明确的成骨分化潜能，易于获得及扩增，其独特的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达，因此成为目前研究最广泛的的组织工程骨种子细胞。MSCs具有成骨潜能，一方面其中的定向性骨祖细胞能自动分化为成骨细胞，另一方面其中的诱导性骨祖细胞在诱导物的作用下也能转化为成骨细胞系。尽管已经有大量的实验证实了MSCs的成骨分化，然而如何通过合适的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
成骨细胞特异性转录因子－２基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是：采用如下的方法制备：（１）种子细胞的获取：所述种子细胞为骨髓间充质干细胞，细胞融合度约为９０％后利用成骨细胞特异性转录因子－２（Ｏｓｆ２）腺病毒感染，感染２４小时 后收集细胞用于与支架材料的复合；（２）天然生物衍生材料的制备：由异种或同种骨组织去除抗原性和细胞成分，保留骨基质的天然孔架结构及力学特性；（３）种子细胞的种植与组织工程化骨的动态培养：完成支架材料的制备后，在支架材料上接种种 子细胞，继而在反应器内动态培养５－７天。

【技术特征摘要】
1.成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是采用如下的方法制备(1)种子细胞的获取所述种子细胞为骨髓间充质干细胞，细胞融合度约为90％后利用成骨细胞特异性转录因子-2(Osf2)腺病毒感染，感染24小时后收集细胞用于与支架材料的复合；(2)天然生物衍生材料的制备由异种或同种骨组织去除抗原性和细胞成分，保留骨基质的天然孔架结构及力学特性；(3)种子细胞的种植与组织工程化骨的动态培养完成支架材料的制备后，在支架材料上接种种子细胞，继而在反应器内动态培养5-7天。2.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中骨髓间充质干细胞的获取如下抽取骨髓悬液约2ml，缓慢加至预先加入Percoll分离液5mL的离心管中，以2000r/min×20min离心，收集界面的单核细胞层，以2×105/cm2的密度接种于25ml培养瓶；24h后换液，弃取未贴壁细胞，此后每周半量换液2次，逐日观察；14d后单层细胞基本融合；0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2传代。3.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中携带人Osf2基因腺病毒载体构建如下设计引物上游5’-GAAGATCTTCATGGCATCAAACAGCCTCTT-3’；下游5’-GCCTCGAGCGTCAATATGGTCGCCAAACAGATTCA-3’，抽提成骨细胞总RNA，用RT-PCR方法克隆人Osf2基因cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle-CMV的BglII和XbaI位点，既而利用细菌内重组原理与骨架质粒pAdeasy-1重组得到pAdEasy-1/Cbfal质粒，脂质体法转染293细胞，重组腺病毒在293细胞大量扩增繁殖，纯化。4.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中Osf2腺病毒感染骨髓间充质干细胞的具体操作如下将MSCs以2×104/cm2的密度传代于6孔板，约3d后细胞融合约90％时，加入感染复数(MOI)＝50的Osf2重组腺病毒，感染1小时后PBS洗2次，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：董世武，应大君，谢肇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]