构建组织工程软骨的混合细胞方法技术

一种构建组织工程软骨的混合细胞方法，涉及一种软骨组织工程方法的改进，其方法是：１．从供体获取软骨组织后，采用Ⅱ型胶原酶消化法获取原代软骨细胞；２．抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞；３．混合培养。其有益效果是：１．细胞来源充足。２．方法简便。３．ＭＳＣｓ向软骨转化率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗
，涉及一种软骨组织工程方法的改进。
技术介绍
种子细胞的不足是软骨组织工程所面临的难题之一，目前比较成熟的自体软骨细胞移植一次大约需要4.5×106的细胞，而构建动物实验所需的人工软骨也要2.0×106的细胞。为了解决种子细胞不足的问题，世界各国的学者进行了大量的研究，如诱导骨髓间充质细胞向软骨细胞转化、诱导胚胎干细胞向软骨细胞转化、软骨细胞永生化研究等，但是在如何更有效利用原代软骨细胞方面尚未见报道。自体和同种异体软骨细胞是目前软骨组织工程的主要细胞来源，但是分离得到的软骨细胞数量有限，虽然经过培养扩增后可以得到较多的细胞，但长期传代不可避免地会出现反分化现象。因此软骨细胞长期单层传代培养不利于为软骨组织工程提供种子细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类有多向分化潜能的组织干细胞，这类细胞特性稳定，扩增后细胞同质性可达95-98％，连续传代培养和冷冻保存后仍有多向分化潜能，但不能自发分化。在体外特定诱导条件下MSCs可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等组织细胞。大量研究表明骨髓基质细胞用TGF-β和bFGF培养诱导后可以转化为软骨细胞，且使II型胶原分泌增加。MSCs来源广泛，特别是骨髓的来源充足、取材方便、对供体部位损伤小、术后并发症少，最重要的是取自体骨髓MSCs不会产生免疫排斥反应，不涉及伦理问题，但是在MSCs定向诱导等方面还存在不少问题需要解决，而且在移植后由于离开诱导环境，许多诱导的软骨细胞发生退化导致移植远期效果差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种仅需少部分原代软骨细胞即可成倍获得供体软骨细胞的。本专利技术的技术方案是1)从供体获取软骨组织后，采用II型胶原酶消化法获取原代软骨细胞。2)抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞(MSCs)。3)混合培养所得原代软骨细胞和间充质干细胞(MSCs)计数后，将两种细胞按比例混匀，使其中软骨细胞所占比例为60％-80％，然后接种到培养板中，放入37℃、5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱中进行培养。由于软骨细胞可以分泌TGF-β及其它一些因子，同时间充质干细胞(MSCs)可以直接与软骨细胞接触，因此可以诱导间充质干细胞转化为软骨细胞。培养7-10天后培养板中细胞就成为软骨细胞。本专利技术的有益效果是1、细胞来源充足仅需少部分软骨细胞即可成倍获得供体软骨细胞。2、方法简便，无需添加昂贵的促使MSCs向软骨细胞转化的诱导剂(如转化生长因子等)，就可以使MSCs转化为软骨细胞。3、MSCs向软骨转化率高，所诱导的软骨细胞一直处于诱导环境中，软骨细胞发生退化少，远期移植效果好。具体实施例方式实施例11)从供体获取软骨组织后，采用II型胶原酶消化法获取原代软骨细胞。2)抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞(MSCs)。3)混合培养取所得软骨细胞和间充质干细胞(MSCs)计数后，将两种细胞按比例混匀，使其中软骨细胞所占比例为70％，然后接种到24孔培养板中，培养板预置涂有多聚赖氨酸(PLL)的玻片，使细胞在玻片上生长。隔日换一次培养液(IMDM培养液，补充15％的新生牛血清、50mg/L维生素C、青霉素100U/mL、链霉素100U/ml，pH7.2)。混合培养10天后取出盖玻片进行检测。4)混合细胞培养后的细胞形态学变化及免疫细胞化学检查所见软骨细胞与骨髓间充质干细胞混合培养时，在培养3天后，软骨细胞以多个细胞的聚集体在视野中散在分布，软骨细胞所见到的软骨陷窝，在形态上与单纯的软骨细胞培养结果相同，在聚集体周围围绕着梭型骨髓间充质干细胞，随着培养时间的延长，与软骨细胞相邻的骨髓间充质干细胞形态逐渐发生变化，由梭形变成不典型形态。培养10天后在HE染色及甲苯胺蓝染色时均显示围绕在软骨细胞周围的间充质干细胞(MSCs)已经出现软骨样改变，几乎所有的间充质干细胞(MSCs)均呈现软骨细胞异染性，而且细胞融合时间较长。经II型胶原免疫细胞化学染色，几乎所有的细胞均呈现II型胶原阳性反应，阳性率为99％。细胞形态学观察及免疫细胞化学检查结果均证明混合细胞中的MSCs已经具备软骨细胞的特征，共培养10天后几乎所有的细胞都是软骨细胞。实施例21)从供体获取软骨组织后，采用II型胶原酶消化法获取原代软骨细胞。2)抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞(MSCs)。3)混合细胞离心法构建人工软骨所得软骨细胞和间充质干细胞(MSCs)计数后，将两种细胞按比例混匀，使其中软骨细胞所占比例为80％，然后按1.5×105/ml的细胞密度将混合细胞移入15ml离心管内，轻微离心细胞，使其积聚于离心管底部，可见有小的细胞团形成，继续体外培养，隔日换一次培养液(IMDM培养液，补充15％的新生牛血清、50mg/L维生素C、青霉素100U/mL、链霉素100U/ml，pH7.2)。3天后移到6孔培养板中，便于观察并使其生长不受离心管壁的限制。10天后细胞团块常规石蜡包埋、切片后进行检测。4)组织形态学观察及免疫组织化学检查所见从第3天起，所培养的软骨细胞团块体积均逐渐增大，培养到第10天后，增大不再明显。在HE染色及甲苯胺蓝染色时均显示围绕在软骨细胞周围的间充质干细胞(MSCs)已经出现软骨样改变，细胞有95％呈现软骨细胞异染性。免疫组织化学检查发现围绕软骨细胞的间充质干细胞(MSCs)，经II型胶原免疫组化染色呈阳性反应，几乎所有的细胞均呈现II型胶原染色阳性反应。组织形态学观察及免疫组织化学检查结果均证明混合细胞中的MSCs已经具备软骨细胞的特征，几乎所有的细胞都是软骨细胞，采用混合细胞的方法成功构建了组织工程软骨。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建组织工程软骨的混合细胞方法，其方法是：　　　　ａ）从供体获取软骨组织后，采用Ⅱ型胶原酶消化法获取原代软骨细胞；　　　　ｂ）抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞；　　　　ｃ）混合培养　　　　所得原代软骨细胞和间充质干细胞计数后，将两种细胞按比例混匀，使其中软骨细胞所占比例为６０％－８０％，然后接种到培养板中，放入３７℃、５％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱中进行培养；由于软骨细胞可以分泌ＴＧＦ－β及其它一些因子，同时间充质干细胞可以直接与软骨细胞接触，因此可以诱导间充质干细胞转化为软骨细胞；培养７－１０天后培养板中细胞就成为软骨细胞。

【技术特征摘要】
1.一种构建组织工程软骨的混合细胞方法，其方法是a)从供体获取软骨组织后，采用II型胶原酶消化法获取原代软骨细胞；b)抽取供体骨髓，并采用密度梯度离心分离的方法纯化间充质干细胞；c)混合培养所得原代软骨细胞和间充质干细胞计数后，将两种细胞按比例混匀，使其中软骨细胞所占...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹飞，郭丽，
申请(专利权)人：尹飞，郭丽，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]