丝状真菌中DNA表达文库的高通量筛选制造技术

本发明专利技术提供了一种在丝状真菌中表达外源基因DNA文库的方法。该真菌可以处理有内含子的真核基因，并且也可以进行诸如糖基化、蛋白质折叠的翻译后加工。本发明专利技术提供了形态学改变的真菌的用途，其允许高通量筛选和对表达蛋白直接改造。所述转化的真菌可以用于生产大量的蛋白质，用来进行蛋白质的分离、测定和应用测试，也许还适合于蛋白质的商业化生产。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
丝状真菌中DNA表达文库的高通量筛选专利技术概述本专利技术提供了一种在丝状真菌宿主中表达和后继筛选DNA文库，尤其是合成文库、基因组文库和cDNA文库的方法。该系统采用转化或转染的丝状真菌，这些真菌在深层培养中通过诸如有效的孢子形成等途径产生可转移的复制单元。这些真菌优选表现这样一种形态，即很少或不形成纠缠的菌丝体。其中更为优选的菌株还能表达可分离量的外源蛋白，用于评测。本专利技术的突变的真菌菌株由于产生可转移的复制单元、可高水平的表达外源基因、以及非常低的培养粘度，因此它们非常适合高通量的筛选技术。
技术介绍
天然微生物种群表现广泛的生化和代谢多样性。由于许多微生物的分离和培养非常困难，这些微生物中大量有潜在价值的蛋白质和多肽不能被发现。事实上，据估计目前全世界只有不到的微生物被分离和培养。专利技术新的方法从未被认知乃至已被分离的微生物中分离蛋白质、多肽和代谢物仍然是一个迫切的需求。(术语“蛋白质”在后面的文章中应被理解为包括蛋白质和多肽。)鉴定和分离编码这些蛋白质的基因，从而能修饰和/或生产这些蛋白质也是人们所需要的。Short在美国专利5938672、6001574、6030779和6057103(它们的内容通过参考合并到本专利技术中)中阐述了解决这一问题的一个途径。在该方法中，他们直接从环境样品(如土样)中制备了基因组DNA文库，而没有试图从中分离或培养任何可能存在的生物。该文库在大肠杆菌中被表达，并从获得资源甚至纯粹兴趣的角度筛选表达的蛋白。Short暗示， 但没有明确论述或肯定在该方法中使用了真菌宿主细胞。上述方法有许多重大缺陷，其中之一就是大肠杆菌不能有效地表达有内含子的基因。土壤中大约90%的物种是真核生物(主要是真菌)，因此其中大部分生物的基因组 DNA中有内含子。虽然已经发现的真菌有大约10万种，但是估计大约有100万种真菌仍未被发现(B. Kendrick，《第五界》，Mycologue出版社，1999)，真菌基因组编码蛋白质和代谢物的潜在多样性远比已知的真菌高，但是由于内含子的存在，使得绝大部分真菌特有蛋白和代谢物不能在细菌表达系统中有效表达。不仅许多种酶类(例如分泌形真菌木质素过氧化物酶和锰依赖型过氧化物酶)是真菌特有的，而且有许多真菌蛋白，包括酶类(例如木质素过氧化物酶和黑曲霉蔗糖酶)是糖基化的；但是如果这些蛋白在大肠杆菌中表达就不能被糖基化。由于真菌基因组的数量大，长度和复杂度非常高，许多蛋白是真菌特有的，并且许多真菌蛋白都要进行糖基化，所有这些都表明，如果将给定的环境微生物样品的基因组DNA 在细菌中进行表达，能被细菌识别并正确表达的微生物蛋白和代谢物的丰度不超过10%。部分由于爱滋病的蔓延和接受器官移植的人数量的增加，越来越多的人受到免疫损害或免疫抑制，导致真菌感染的数量和种类稳步增长(《传染病医学杂志》16 :380-382， 385-386(1999))。因此正在进行的研制新抗真菌药的过程中需要分离和鉴定来自致病真菌的蛋白质，而这又需要有筛选来源于真菌基因组的DNA文库的能力。由于真菌基因组中内含子的存在，使得在目前已知的绝大多数细菌宿主细胞中表达这些文库变得非常困难。同样，由于越来越多的细菌感染对抗生素产生抗药性，也需要对有抗生素活性的真菌代谢物进行高通量筛选。真核生物的基因组太复杂，以至于不能在细菌中完全表达其DNA文库。如果算上所有的真核生物，细菌只代表所有已知物种的0.3% (E.O.Wilson，“生物多样性的现状〃，《生物多样性》，国家学术出版社，华盛顿特区，1988，第一章)；因而能在细菌中表达的全世界基因多样性是极其有限的。为了避免内含子的问题，可以构建cDNA文库在细菌中表达。但是这种方法必须有转录产物RNA的存在，而任何当时未被活跃转录的基因都不会出现在该文库中。而许多我们需要的蛋白只在特定条件下才表达(例如致病真菌中的毒性因子)，并且不一定在收获 mRNA时存在。而且，为了获得足够量的RNA构建DNA文库，需要培养大量的菌体。对于环境样品中不易培养的生物，或者新的适宜培养条件还未找到的微生物而言，获得大量的RNA 是困难或不可靠的。相比之下，通过很少量的单个细胞，采用随机引物或适合某一类基因的引物进行PCR扩增，就能获得足够的基因组DNA。最后，在某个生物体中表达量高的基因也会导致其mRNA的超量合成，而在基因文库中，它的超量合成是以掩盖一些微量表达的基因为代价的。如果是构建cDNA文库而不是基因组文库，为了包括尽可能多的现存mRNA种类， 必须要筛选多得多的克隆，因为后者更能均衡地代表现存的基因种类。显然，如果可能的话，人们更愿意构建基因组DNA文库。并且，大肠杆菌不能将许多蛋白质分泌出来，这对于用于筛选目的，而筛选依赖于宿主细胞将外源基因产物分泌到胞外的宿主细胞是一个缺陷。对于大肠杆菌和所有细菌宿主细胞来说，另一个缺陷是，许多真核生物蛋白需要多种翻译后加工以获得活性，而细菌不能对它们进行翻译后加工。除了糖基化，亚基切分、二硫键形成和蛋白的正确折叠是生成有活性蛋白所常需的翻译后加工的范例。为了保证这些翻译后加工，有时可以利用哺乳动物细胞，但是这些细胞很难培养， 需要昂贵的培养基，并且不总是能高效地转化外源基因。虽然科学家们努力尝试用哺乳动物细胞做CDNA文库筛选的宿主(Schouten et al. , WO 99/64582)，但这种转化系统显然不适合蛋白质的高通量筛选。一种在文库筛选前将转化的原生质体与哺乳动物细胞融合的方法已被报道(美国专利5，989，814)，但是细菌或酵母细胞中蛋白质文库的表达发生在细胞融合之前。有人试图用酶在宿主细胞表达外源蛋白后对蛋白的糖基化方式进行改造(Meynial-salles 和 Combes，J. Biotechnol. ,46 1-14(1996)),但是这种方法必须针对不同的蛋白而改变，并且不适用于从DNA文库中表达蛋白。在更近一些时候，Maras et al.，Eur. J. Biochem.，249 :701-707(1997)(又见美国专利 5，834，251)报道一株里氏木霉 (Trichoderma reesei)基因工程菌表达人类乙酰糖苷(GlcNAc)转移酶I。该酶将所表达的其它外源基因的N-乙酰葡萄糖苷转化为甘露糖残基，这是向有天然活性的哺乳动物蛋白迈进的第一步。用酵母作为宿主细胞解决了上述的一些问题，但却引入了新的问题。酵母倾向于过度糖基化外源蛋白质(Bretthauer 和 Castellino, 1999，Biotechnol. Appl. · Biochem. 30 :193-200)，而由于糖基化方式的改变，常使得表达的哺乳动物蛋白质具有高抗原性(C. Ballou, Molecular Biology of the yeast saccharomyces (酵母的分子生物学)，J. Strathern et al.，eds.，Cold Spring Habor Laboratory Press, NY, 1982, 335-360)。虽然酵母可以应付少数一些内含子，但是它们基本上不能处理从高等物种，比如脊椎动物的复杂基因。即使来自丝状真菌的基因对于酵母来说也太复杂以至不能有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种产生由一组ＤＮＡ载体库编码的多种具有所需活性或特性的蛋白质的方法，其中载体库包括多种不同的载体，每种不同的载体都包含一种不同的编码蛋白质的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于一种表达调控区和任选连接一种分泌信号编码序列，所述方法包括以下步骤：（ａ）提供一种具有悬浮生长表型特征的丝状真菌株，并且具有在悬浮条件下产生可转移性复制单元的特征，所述单元是单克隆的，并容易分散；（ｂ）使用上述ＤＮＡ载体库稳定转化上述丝状真菌株，使每个单一菌株都至少含有至少一种编码外源蛋白的核酸序列；（ｃ）将转化的丝状真菌突变株在有利于形成可转移性复制单元的悬浮培养条件下培养，所述单元是单克隆的，并容易分散；（ｄ）将多种悬浮的可转移性复制单元相互分离；和（ｅ）将分离的可转移复制单元移到第二培养物；和（ｆ）在有利于外源蛋白编码核酸序列表达外源蛋白的条件下，将在所述第二培养物中的单个可转移性复制单元培养成单克隆培养物或单克隆。

【技术特征摘要】
2000.04.13 US PCT/US00/101991.一种产生由一组DNA载体库编码的多种具有所需活性或特性的蛋白质的方法，其中载体库包括多种不同的载体，每种不同的载体都包含一种不同的编码蛋白质的核酸序列， 所述核酸序列可操作地连接于一种表达调控区和任选连接一种分泌信号编码序列，所述方法包括以下步骤(a)提供一种具有悬浮生长表型特征的丝状真菌株，并且具有在悬浮条件下产生可转移性复制单元的特征，所述单元是单克隆的，并容易分散；(b)使用上述DNA载体库稳定转化上述丝状真菌株，使每个单一菌株都至少含有至少一种编码外源蛋白的核酸序列；(c)将转化的丝状真菌突变株在有利于形成可转移性复制单元的悬浮培养条件下培养，所述单元是单克隆的，并容易分散；(d)将多种悬浮的可转移性复制单元相互分离；和(e)将分离的可转移复制单元移到第二培养物；和(f)在有利于外源蛋白编码核酸序列表达外源蛋白的条件下，将在所述第二培养物中的单个可转移性复制单元培养成单克隆培养物或单克隆。2.一种在由DNA载体库编码的多种蛋白质中筛选具有所需活性或特性蛋白质的方法， 包括以下步骤(a)按照权利要求1的方法在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白质；和(b)筛选单个克隆培养物或克隆菌落的所需活性或特性。3.一种得到编码具有所需活性或特性的蛋白质的DNA分子的方法，包括以下步骤(a)按照权利要求1的方法，在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白；(b)在单个克隆培养物或克隆菌落中筛选具有所需特性或活性的蛋白；和(c)从表现出所需特性或活性的克隆培养物或克隆菌落中分离DNA。4.一种得到编码具有所需特性或活性蛋白的DNA分子的核苷酸序列的方法，包括以下步骤(a)按照权利要求3的方法从表现出所需特性或活性的克隆培养物或克隆菌落中分离 DNA ；和(b)将上述DNA测序。5.一种得到具有所需特性或活性蛋白的氨基酸序列的方法，包括以下步骤(a)按照权利要求4的方法，得到编码具有所需特性或活性蛋白的DNA序列；和(b)将上述DNA序列转化成氨基酸序列。6.一种从多种单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中筛选具有所需活性或特性的代谢物的方法，包括以下步骤(a)按照权利要求1的方法，在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白；和(b)在每个单一克隆培养物或克隆菌落中筛选所需特性或活性。7.一种优化所需蛋白活性或特性的方法，包含如下步骤(a)提供一种包含编码蛋白质突变型的DNA序列的载体库；(b)提供一种表型特征为可悬浮生长和在悬浮条件下产生可转移复制单元的丝状真菌株，所述单元是单克隆的，并容易分散；(c)使用上述DNA载体库稳定转化上述丝状真菌株，使每个单一菌株都至少含有一种编码外源蛋白的核酸序列；(d)在有利于形成可转移复制单元的条件下培养转化的丝状真菌株，所述单元是单克隆的，并容易分散；(e)将多种悬浮的可转移性复制单元相互分离；(f)在有利于由外源蛋白编码核酸序列编码的外源蛋白表达的条件下，将单一可转移复制单元培养成单克隆培养物或克隆菌落；(g)在各生物体、克隆培养物或克隆菌落中筛选具有所需特性或活性的表达蛋白；(h)分离一个或多个表达具有所需活性或特性蛋白的单一生物体、克隆培养物或克隆菌落；(i)从编码表现所需活性或特性蛋白的分离的单一生物体、克隆培养物或克隆菌落中分离DNA，并对其进行突变；(j)提供包含⑴步骤中得到的突变DNA序列的载体库；和(k)重复步骤(b)到(g)直到所需活性或特性达到满意的水平或不再提高。8.权利要求7的方法，在步骤(h)和(i)间进一步包含如下步骤培养一个或多个在步骤(h)中分离到的单一生物体，克隆培养物或克隆菌落；分离表现出所需特性或活性的表达蛋白；对所分离蛋白的所需活性进行评价。9.权利要求2的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。10.权利要求3的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。11.权利要求4的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。12.权利要求5的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。13.权利要求6的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。14.权利要求7的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。15.权利要求8的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。16.权利要求1-15中任一权利要求的方法，其中真菌表型特征为在优化或近优化条件，有充分营养物的悬浮培养时，发...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·扬·蓬特，科妮莉亚·范塞尔，科尔内留斯·范登洪德，
申请(专利权)人：戴亚蒂克国际美国公司，
类型：发明
国别省市：US