多靶标干扰核酸分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多靶标干扰核酸分子及其应用。该干扰核酸分子由一条反义链和一条正义链组成，双链的总长度至少为30个核苷酸，且在正义链上或反义链上或正、反义链两条链上存在核苷酸缺刻或缺口。该干扰核酸的任意一条链可以靶向至少两个靶RNA，从而干扰转录后翻译过程，并且该干扰核酸不引起干扰素反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多靶标干扰核酸分子及其应用。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种转录后的基因沉默效应，是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA识别有同源序列的信使RNA (messenger RNA,mRNA)， 对其特异性切割，从而阻断其翻译的过程。与传统的抑制基因表达的反义寡核苷酸技术和核酶技术相比，小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默基因表达的效果要强大数十倍至数百倍，现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。RNAi发挥基因沉默作用的机制是长双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)进入细胞后，与Dicer酶结合并被切割。Dicer酶的切割产物通常是长度为20_2^ρ，且在每个链的3’末端有两个核苷酸悬垂的siRNA。siRNA与RNA-诱导的沉默复合物(RISC)结合， RISC首先介导siRNA双链的解旋并与siRNA双链中的一条链，通常是反义链偶联。装载有 siRNA —条链的RISC以序列特异的方式寻找识别与之匹配的mRNA，之后由RISC的催化组分-Argonaute蛋白切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制转录该mRNA的基因的表达。RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域。其中应用siRNA治疗老年黄斑变性，呼吸道合胞病毒以及急性肾衰等疾病已进入临床试验阶段。其他可能的临床应用主要集中在抗病毒治疗方面，包括沉默HIV的宿主受体的表达，沉默甲型肝炎，乙型肝炎和丙型肝炎基因的表达，沉默流感基因表达以及抑制麻疹病毒的复制等。RNAi也有望用于神经组织退化型疾病，如亨廷顿氏舞蹈病的治疗。此外，RNAi通过沉默肿瘤细胞中特异性高表达的基因或在细胞分裂中起作用的基因为癌症的治疗提供了一个新方向。引发RNAi效应的dsRNA可设计成能被Dicer剪切的长双链形式，叫做Dicer底物， 或者是不需Dicer剪切可直接作为RISC底物的短siRNA形式。在哺乳动物细胞中，由于长 dsRNA引发非特异反应，导致干扰素效应。因此，普遍认为应用于哺乳动物时，干扰RNA双链必须短于30bp以抑制干扰素效应。但是，设计长双链干扰RNA用于RNAi仍有实用价值。长干扰RNA双链可带有多个治疗靶标，靶向多个不同的mRNA或同一 mRNA的不同位点，增加基因沉默效果，扩大应用范围。以肿瘤的治疗为例，由于肿瘤是一种多基因疾病，它的发生、发展是一个多步骤、多因素参与的复杂的生物学过程，因此，单一癌基因的抑制不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，单靶标治疗有其局限性。那么，研发多靶标、无干扰素反应的长干扰核酸双链，同时抑制多个癌基因的表达，多层次、多途径治疗肿瘤，可能有效提高治疗效果， 成为治疗肿瘤的新策略。
技术实现思路
本专利技术所公开的组合物及其作用过程需要通过干扰核酸双链实现，该干扰核酸的反义链靶向到两个或多个mRNA、或靶向到两个或多个微小RNA(microRNA，miRNA)、或靶向到两个或多个mRNA或miRNA的子序列，并且该干扰核酸不引起体内的干扰素反应。在一个实施例中，该多靶标干扰核酸由不连续的反义链和连续的正义链组成，其中反义链靶向两个或多个不同基因的mRNA或同一基因mRNA的两个或多个不同位点，且转染到细胞中不会引起长双链核酸诱发的干扰素效应。在另一实施例中，该多靶标干扰核酸的正义链不连续而反义链连续，且反义链靶向两个或多个不同基因的mRNA或同一基因mRNA的两个或多个不同位点。转染到细胞中不会引发干扰素效应。本专利技术提供了一种干扰核酸分子，该干扰核酸分子由含一个5’末端和一个3’末端部分的正义链与含一个5’末端和一个3’末端部分的反义链退火而成。其中，反义链至少含两个部分，一个部分靶向第一个RNA，反义链的另一个部分靶向第二个RNA，或者反义链的一个部分靶向某一 RNA的第一个部分，反义链的另一个部分靶向同一 RNA的第二个部分。该干扰核酸在转染进细胞后不引发干扰素反应。本专利技术还公开了一种由两条或多条正义链与两条或多条反义链组成的多靶标干扰核酸分子。其中，反义链与正义链退火以产生干扰核酸分子，在反义链上至少有一个缺刻或一个核苷酸缺口，同时在正义链上至少有一个缺刻或一个核苷酸缺口，每条反义链靶向不同的mRNA或一个mRNA的不同位点，并且至少一条正义链靶向一个mRNA，且上述干扰核酸分子长度至少为30-80个核苷酸。这种不连续的干扰核酸分子结构不会引起哺乳动物细胞的干扰素效应。通常，干扰核酸分子由一条反义链和一条正义链组成，分子的总长度至少为30个核苷酸，且干扰核酸分子的任意一条链或两条链上有一个或多个缺刻或缺口，将正义链或反义链分割成多段。长度在30个核苷酸之上的双链RNA导入哺乳动物细胞质后会引发干扰素反应，但应用这种分段的正义链或反义链构成的长干扰核酸却没有激发哺乳动物细胞的干扰素反应。本专利技术还提供了利用多靶标干扰核酸分子下调或沉默多个目的基因表达的方法， 有望在抑制、缓解或减轻病情或防止某些疾病症状的复发方面比单靶标SiRNA取得更显著的治疗效果。本专利技术与现有技术相比，多靶标干扰核酸分子能够同时抑制多个靶基因的表达， 或者靶向一个基因的多个位点，基因沉默效果优于单靶标siRNA。此外，虽然该干扰核酸分子长度大于30bp，但由于结构特殊，并未引起干扰素效应，可应用于哺乳动物细胞。本专利技术公开的多靶标干扰核酸分子是一种新的siRNA的应用形式，在对疾病的基因治疗方面可能有广泛的应用前景。附图说明图1是实时定量PCR检测各实验组Survivin基因的mRNA表达量柱形图。图2是实时定量PCR检测各实验组Bcl-2基因的mRNA表达量柱形图。图3是实时定量PCR检测各实验组干扰素相关基因OASl的mRNA表达量柱形图。图4是实时定量PCR检测各实验组干扰素相关基因IFNi3 1的mRNA表达量柱形图。图5是WST-8法检测各实验组膀胱癌TM细胞的生长曲线图。图6是转染了不同干扰核酸分子后TM细胞生长的抑制率柱形图。具体实施例方式本专利技术中术语的定义应该用来解释包含没有详述的此领域中相关的术语，并非是对本专利技术进行限制。本专利技术中术语干扰核酸是指有正义和反义链的核苷酸双链，能够在进入RNA诱导沉默复合物(RISC)后诱导靶RNA酶降解。一般情况下，每条链大部分是RNA核苷酸，但可以包含RNA类似物、RNA和RNA类似物、RNA和DNA、RNA类似物和DNA，或一条链与DNA互补且一条链是长度与干扰核酸结构相同的RNA，诱导同源靶RNA酶降解。本专利技术中术语“干扰核酸”包括小干扰核酸、能够在体内切割成小干扰核酸的发卡核酸。干扰核酸还包括能在细胞中引发转录本形成干扰核酸分子或发卡干扰核酸的表达载体(也指干扰核酸表达载体)，或该转录本能够在体内产生小干扰核酸分子。该干扰核酸分子包括可形成发卡环或双链干扰核酸的单链。干扰核酸是一种由互补的正义和反义链组成的双链多聚核苷酸分子，该反义链包含一段或部分与一种调节表达的靶基因核苷酸分子互补的核苷酸序列。正义链或反义链带有一个或多个缺刻或缺口。干扰核酸的末端结构可以是平端或粘性末端(悬垂)，且该干扰核酸能本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种多靶标干扰核酸分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成，每条链的长度至少为３０个核苷酸，其正义链或反义链的至少一个部分，分别靶向不同基因的ＲＮＡ或同一基因的ＲＮＡ的不同位点，该多靶标干扰核酸分子转染进入细胞后不会引起干扰素效应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭薇，唐小军，孙云成，陆毅祥，王晋康，朱远源，
申请(专利权)人：百奥迈科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32