本发明专利技术涉及一种磁性复合微球固定化漆酶及其制备方法，属于环境微生物领域。该固定化漆酶是以金属螯合的磁性复合微球为载体，通过配位键合作用将漆酶固定在该载体上。其制备方法包括两个步骤：载体制备和漆酶固定。载体制备是先利用化学沉淀法合成磁性四氧化三铁纳米粒子，以该纳米粒子为核，利用溶胶-凝胶法制得核壳式磁性二氧化硅，再以γ-氯丙基三甲氧基硅烷为媒介，在磁性二氧化硅表面接枝一种含羰基或氨基的聚合物，然后通过螯合一种过渡金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+)制得可固定漆酶的功能化载体；漆酶固定是将漆酶配位吸附在该载体表面，再经洗涤、干燥得到固定化漆酶成品。采用本发明专利技术方法制备得到的固定化漆酶稳定性好、活性高，具有快速磁响应性能，易从反应体系中回收、可反复多次使用，制备过程简单，成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种磁性复合微球固定化漆酶和该固定化漆酶的制备方法。更具体的说是制备一种可快速磁性分离，操作稳定性良好的磁性复合微球固定化漆酶。
技术介绍
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在多种生物体内。漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A、芳香胺等，在漆酶介体 (ABTS、HBT等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N-取代对苯基二胺、有机磷化合物(农药)及二噁英等。由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在造纸工业、废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、生物传感器构建及食品工业等方面具有重要的使用价值。但由于漆酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处环境十分敏感， 在使用过程中易受环境条件变化影响而导致变性失活，特别是游离酶与反应产物混合在一起，反应后不能回收，难以实现重复利用。而对酶进行固定后制成的固定化酶能克服上述缺点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还存在稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。制备固定化酶的关键在于载体的选择，文献报导较多的可用于生物酶的固定化载体主要有表面富含功能基团的有机载体和机械稳定性较好的无机载体等。但这些载体材料普遍存在着合成价格昂贵，加工工艺复杂，分离效果差等缺点。近年来，随着磁性分离技术的日益发展，磁性粒子用于生物酶的固定化逐渐受到人们的广泛关注。然而磁性纳米粒子具有高比表面积、高比表面能，以及粒子各向异性的偶极矩作用从而很容易团聚，而且裸露的磁性材料耐酸碱性能差，在空气中容易氧化变质，从而导致不能形成稳定的分散体系，使其在磁性分离的应用中受到了限制。这就要求对于这些磁性材料进行改性，通常需要在外面包裹上保护层，以提高磁性材料的抗氧化能力，得到分散性较好的复合粒子。二氧化硅具有很好的生物相容性，良好的耐酸碱、耐有机溶剂及耐高温特性，对磁性纳米粒子的表面修饰可以降低其表面能，提高粒子的抗氧化能力，得到分散性好的纳米复合粒子，同时可用各种硅烷偶联剂在其表面引入各种官能基以用于酶等生物大分子的固定化。因此，二氧化硅包覆磁性粒子有无可比拟的优势。近年来，固定化酶技术的研究得到了蓬勃的发展，目前用于固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价键结合法、包埋法等。其中，交联法和共价键结合法因反应条件较为剧烈，酶活力损失较大；包埋法由于底物结合部位和活性中心受载体封闭因而酶活损失较大；吸附法具有条件温和、酶活力部位及其空间构象不易被破坏的特点，但吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易受反应介质的PH、离子强度等的影响而从载体上脱落。而采用金属螯合载体以配位作用固定化酶则能克服目前常用固定化方法中的一些不足。它利用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸-组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯醇基等以配位作用固定酶，酶与载体结合牢固不易脱落，同时避免了交联剂的使用对酶分子造成的化学损伤，更大程度上保持了酶分子的天然构象，可以更大限度保留酶活。因此，在本专利技术中，通过在磁性二氧化硅表面螯合一种过渡金属离子(如Cu2+、 Zn2\ Ni2+或Co2+)制得可固定漆酶的功能化磁性载体，以该载体通过配位作用固定化漆酶， 该固定化漆酶不仅可以在外界磁场作用下实现快速分离，可回收反复使用，同时也增强了漆酶的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可快速磁性分离回收，操作稳定性良好的磁性复合微球固定化漆酶。本专利技术的又一目的在于提供上述固定化漆酶的制备方法。本专利技术的目的通过如下技术方案实现一种磁性复合微球固定化漆酶，以表面螯合一种过渡金属离子(如Cu2+、Zn2\ Ni2+ 或Co2+)的磁性复合微球为载体，利用金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上。一种磁性复合微球固定化漆酶的制备方法，该方法包括两个步骤载体制备和漆酶固定。载体制备步骤包括(1)将溶有FeCl2 ·4Η20和FeCl3 ·6Η20混合物的十二烷基磺酸钠水溶液均勻混合， 在搅拌条件下滴加2-5mol/L NaOH溶液至混合液pH为10-12，所得产物在80-100°C水浴中熟化30-60min后，在50_70°C下烘干，通过研磨得到四氧化三铁粉末；(2)将四氧化三铁粉末超声分散于二次水中，搅拌下加入正硅酸乙酯和甲醇的混合溶液，持续搅拌15min后滴加浓氨水，继续搅拌反应4小时，50-70°C下烘干，得到核壳结构磁性二氧化硅粉末；(3)将磁性二氧化硅粉末和Y-氯丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇和丙三醇混合溶液中，80°C下搅拌反应3小时后，50-70°C下烘干，得到硅烷化的磁性二氧化硅；(4)将1.4g硅烷化的磁性二氧化硅与175mL 0. 5-10mg/L的一种含羰基或氨基的聚合物溶液在50°C下搅拌反应3小时，50-70°C下烘干；将0. 5g该烘干粉末与75mL 0. 02-0. 3mol/L含一种过渡金属离子(如Cu2+、Zn2\ Ni2+或Co2+)的硫酸盐溶液混合震荡， 温度为25-30°C，震荡时间8-12小时，然后在50-70°C下烘干即得载体成品。漆酶固定步骤包括将经载体制备步骤制得的载体成品与溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的游离漆酶5mL充分混合，在pH为2. 5-6. 0、温度为5_55°C条件下搅拌1_16小时，4°C条件下静置 8-12小时后，用pH为3. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出，再经低温真空干燥制得固定化漆酶成品。在上述过程中，载体制备步骤(1)中所述的溶有狗(12*4!120和!^(13*6!120混合物的十二烷基磺酸钠水溶液的组成为0. 25mol/L的FeCl2 · 4H20、0. 45-0. 5mol/L的 FeCl3 ·6Η20、0. 2-0. 5%质量分数的十二烷基磺酸钠；载体制备步骤( 中所述的甲醇、二次水和浓氨水的组成为80-120体积份的甲醇、40-60体积份的二次水、4-6体积份的浓氨水， 四氧化三铁粉末的浓度为8. 06g/L,正硅酸乙酯的浓度为16. 12-32. 24g/L ；载体制备步骤 (3)中所述的磁性二氧化硅粉末的质量为1. 5g，Y-氯丙基三甲氧基硅烷的体积为5-10mL， 甲醇和丙三醇的体积分别为87. 5mL和37. 5mL ；载体制备步骤中所述的一种含羰基或氨基的聚合物为聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺；漆酶固定步骤中，溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的游离漆酶浓度是0. 2-1. 4g/L，游离漆酶和载体成品的混合比例为10-70mg/lg。本专利技术的特点是(1)漆酶固定化过程中不使用交联剂，避免了交联剂对酶分子造成的化学损伤，酶以配位作用固定在载体上可以更大程度上保持酶分子的天然构象，更大限度保留酶活。(2)所制备的固定化漆酶在磁场作用下可从反应体系中迅速分离，有利于回收和反复利用，显著提高了固定化漆酶的操作稳定性。具体实施例方式以下以具体实施例来说明具体实施方式。实施例1一种磁性复合微球固定化漆酶，制备方法主要包括两个步骤载体制备(1)取摩尔比为1 2的FeCl2 ·4Η20和FeCl3 ·6Η20的混合粉末溶于50mL质量分数为0. 5%的十二烷基磺酸钠溶液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种磁性复合微球固定化漆酶，其特征在于，以表面螯合一种过渡金属离子（如Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋或Ｃｏ２＋）的磁性复合微球为载体，利用金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，贺芙蓉，沈珍瑶，陈晓春，于光认，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。