本发明专利技术涉及一种大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法；木瓜蛋白酶聚体是在孔径大于0.5μm的载体的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。以表面具有羟基的无机或有机大孔材料为固定化酶载体，经载体表面氨基改性、酶吸附、酶沉淀、同步交联最终实现交联木瓜蛋白酶聚体的形成和与大孔载体共价连接的同步完成。制得的固载化酶载酶量高于普通载体固定化酶；采用共价固定方法避免了应用大孔载体造成的酶泄漏，载体形状可依据实际需要调整，最适催化温度和pH，溶剂及热稳定性均有显著改善。本发明专利技术还可应用于其他蛋白酶及脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、果胶酶、氧化酶、L-天冬酰胺酶、天冬氨酸酶、过氧化物酶等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型固定化酶生物催化剂的制备方法，特别是一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法，属于酶的固定化
技术介绍
交联酶聚体(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)是一种新型的固定化酶方法，在制备过程中首先利用沉淀剂使溶解态的酶聚集沉淀，随后对酶沉淀聚体进行共价交联。该方法制得的固定化酶具有较宽的最适催化PH范围和较宽的最适催化温度范围，对高温、有机溶剂、强酸强碱等具有较高的稳定性，是一种高效、稳定的固定化酶方法。然而， CLEAs的机械强度相对较低，粒径较小(通常为微米级)，采用普通的过滤方法难以回收，限制了其在工业上的利用。因此，利用载体固定CLEAs以提高CLEAs机械稳定性和操作回用性的方法近几年来备受关注。2007年Kim等人自制了一种内孔径37nm，通道直径13nm的分子蹄载体 HMMS (Hierarchically-ordered Mesocellular Mesoporous Silica),并米用先吸附后交联两步的方法令酶物理填埋在37nm的内孔形成CLEAs，而不会从13nm的孔道泄露出来，形成类似“瓶中船”式结构(Biotechnol. Bioeng. 2007,96 :210-218)；郭军等也公开了一种通过先沉淀后交联两步将CLEAs物理填埋于孔径为10 300nm，最适孔径为30nm 的多孔微球载体上的方法(中国专利技术专利，申请号200810056594)。李红公开了一种以壳聚糖为原料制备壳聚糖微球，将壳聚糖微球加入木瓜蛋白酶溶液中，再经吸附-交联得到壳聚糖微球固定的木瓜蛋白酶(申请号00117351. 0)，此方法中所选用的壳聚糖载体在酸性溶液中不稳定，容易造成木瓜蛋白酶从载体上脱落。通常的载体固定化酶方法由于载体多为纳米孔径材料，载酶量往往较低(10 30mg/g)，底物与产物的传质也受到一定限制；同时，以非共价方法固定于载体中的酶易于从载体内泄漏造成酶活损失，不利于工业上的重复回收利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体(或称固载化木瓜蛋白酶CLEAs)的制备方法，即利用孔径大于0. 5 μ m的大孔载体，以化学共价法固定木瓜蛋白酶的交联酶聚体，而非物理填埋，从而改善CLEAs操作粒径，增加固定化酶载酶量，提高木瓜蛋白酶的稳定性的方法。为防止孔径增大造成的酶泄漏，采用“同步法”交联， 即在制得CLEAs的同时将其以共价键的形式结合在载体孔道表面。本专利技术提供的是一种以大孔材料为酶的固定化载体，经载体表面氨基改性、酶吸附、木瓜蛋白酶沉淀、同步交联共四步将木瓜蛋白酶以交联酶聚体的形式共价固定于载体上的方法。制备过程中CLEAs的形成和与载体的共价结合在同步完成，如图1所示。本专利技术系一种固定化酶生物催化剂的制备方法的具有以下的制备过程和步骤(1)载体表面氨基改性所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于90 120°C烘干至质量不再改变；将10 30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min，然后加入2 IOg载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为1 3 1 5(g mL)，于50 70°C水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3 4次， 放于90 120°C烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到5 15 μ mol/g ；(2)木瓜蛋白酶的吸附用pH为4 10的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为0. 05 0. 25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1 5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒1 5g，于4 25°C 下振摇吸附2 Mi ；(3)木瓜蛋白酶沉淀吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒1 5g加入到1 IOmL沉淀剂中，继续振摇10 30min ；(4) “同步法”共价交联向步骤(3)中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终浓度为1 5% ；混合均勻，于 4 25°C下交联2 Mh，使沉淀酶聚体在生成CLEAs的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联-固载CLEAs ；所得固定化酶用蒸馏水洗涤3 4 次，冻干即得大孔载体固载化CLEAs颗粒。本专利技术所制备的木瓜蛋白酶聚体，是木瓜蛋白酶聚体是在孔径大于0.5μπι的载体的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。具体说明如下载体表面氨基改性首先对大孔载体表面进行氨基改性，所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，如硅胶，或三氧化二铝，或纤维素中的一种；所选的氨基改性剂为硅烷偶联剂，如 Y-氨丙基三乙氧基硅烷，或Ν-( β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，或Ν-β-(氨乙基)-Y-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的一种。首先将载体洗净，于90 120°C烘干至质量不再改变；将10 30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min， 然后加入2 IOg载体材料，于50 70°C水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3 4次，放于90 120°C烘箱中干燥过夜至质量不再改变。测定载体表面氨基含量为 5 15 μ mol/g。木瓜蛋白酶沉淀吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒1 5g加入到1 IOmL沉淀剂中，所选沉淀剂为乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、乙腈、饱和硫酸铵、聚乙二醇中的一种；继续振摇10 30min。“同步法”共价交联向步骤(3)中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终戊二醛浓度为1 5%。所选交联剂为戊二醛、碳化二亚胺、羟甲基磷化氢或琥珀酰亚胺的一种。混合均勻，于4 25°C 下交联2 Mh，使沉淀酶聚体在生成CLEAs的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联-固载CLEAs ；所得固定化酶用蒸馏水洗涤3 4次，冻干即得大孔载体固载化CLEAs颗粒。大孔载体材料具有较大的内部孔径，较高的孔隙率及良好的化学稳定性和机械强度。本专利技术合理利用大孔载体的孔隙特征，使木瓜蛋白酶CLEAs在形成的同时共价固定于载体的孔隙中，改善了 CLEAs自身的工业化缺陷，达到了固定化酶的目的。本专利技术具有以下优点(1)借助载体孔径大，孔隙率高的优势实现了木瓜蛋白酶的高负载率；(2)载体颗粒粒径和形状可根据装置需要调节，克服了 CLEAs不利于工业应用的缺点；(3)利用“同步法”共价交联-固载酶聚体，避免了大孔径造成的酶泄漏；(4)固定化酶的制备方法简单，无需特殊设备，得到的固定化酶稳定性高，可重复利用，适于间歇和连续化生产。本专利技术所述方法亦适用于其他蛋白酶及脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、果胶酶、氧化酶、L-天冬酰胺酶、天冬氨酸酶、过氧化物酶等。附图说明图1大孔载体“同步法”共价交联-固载酶聚体制备流程；图2(a)为未固载酶之前载体内部孔道形貌；图2(b)为经固载酶后载体内部孔道形貌；图3固载化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游离态酶的最适催化温度比较；图4固载化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游离态酶的最适催化pH比较；图5固载化木瓜蛋白酶CLEAs、CLE本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联－固载木瓜蛋白酶聚体的方法，其特征是步骤如下：（１）载体表面氨基改性所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于９０～１２０℃烘干至质量不再改变；将１０～３０ｍＬ硅烷偶联剂与无水乙醇以１∶１～１∶３比例均匀混合５～３０ｍｉｎ，然后加入２～１０ｇ载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为１∶３～１∶５（ｇ∶ｍＬ），于５０～７０℃水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体３～４次，放于９０～１２０℃烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到５～１５μｍｏｌ／ｇ；（２）木瓜蛋白酶的吸附用ｐＨ为４～１０的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为０．０５～０．２５ｇ／ｍＬ的木瓜蛋白酶溶液；取１～５ｍＬ此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒１～５ｇ，于４～２５℃下振摇吸附２～６ｈ；（３）木瓜蛋白酶沉淀吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒１～５ｇ加入到１～１０ｍＬ沉淀剂中，继续振摇１０～３０ｍｉｎ；（４）“同步法”共价交联向步骤（３）中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终浓度为１～５％；混合均匀，于４～２５℃下交联２～２４ｈ，使沉淀酶聚体在生成ＣＬＥＡｓ的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联－固载ＣＬＥＡｓ；所得固定化酶用蒸馏水洗涤３～４次，冻干即得大孔载体固载化ＣＬＥＡｓ颗粒。...
【技术特征摘要】
1.一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体的方法，其特征是步骤如下(1)载体表面氨基改性所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于90 120°C烘干至质量不再改变；将10 30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min，然后加入2 IOg载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为1 3 1 5(g mL)，于50 70°C水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3 4次， 放于90 120°C烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到5 15 μ mol/g ；(2)木瓜蛋白酶的吸附用pH为4 10的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为0. 05 0. 25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1 5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒1 5g，于4 25°C下振摇吸附2 Mi ；(3)木瓜蛋白酶沉淀吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒 1 5g加入到1 IOmL沉淀剂中，继续振摇10 30min ...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐崴，王梦凡，苏荣欣，何志敏，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12
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