一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，是将携带表达载体的根癌农杆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时后备用；将平邑甜茶组培苗在继代培养基上培养35天，取伸展叶片剪成叶盘，置备用培养物中5分钟，后接种在再生培养基上暗培养1天；将叶盘转接在含头孢霉素的分化培养基上，(25±1)℃下暗培养14天，后置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30天，将获得的不定芽切下，接种在生根培养基上，置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养40天生根；42℃下热处理15分钟，进一步鉴定后获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。
技术介绍
5FgSf^ ^^^MiiJ 北海棠种的一个变种，是典型的具有兼性无融合生殖性状的植物，也是我国特有苹果砧木资源；其树性乔化，耐荫、抗涝能力强，嫁接苹果的亲和力强，是目前苹果生产中已被广泛应用的砧木之一。由于无融合生殖的特点，使得平邑甜茶的传统育种较为困难，通过转基因技术可以平邑甜茶进行性状改良。而在转基因过程中常常用到选择标记基因，它常与目的基因共转化，在选择压的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于获得标记基因的抗性而成活下来，并进一步增殖分化，形成转基因植株，这对转基因植株的获得至关重要。但转基因植株一旦再生成功，标记基因便不再有用，甚至是有害的。因此培育无标记转基因平邑甜茶，目前已成为平邑甜茶分子育种的重要目标，而国内外还没有平邑甜茶这方面的报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，其步骤如下A.构建植物表达载体pl21-Cre_Gus，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，在下在含IOOmg · Γ1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；B.将平邑甜茶组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0. Icm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg · Γ1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25士 1)°C下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30 μ mol · m_2 · s—1的条件下再培养30天，获得转化芽；D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30 μ mol · m_2 · s—1的条件下培养40天，即可完成生根；E.取步骤D中得到的转化植株的幼叶进行PCR和⑶S鉴定获得转基因植株；F.将步骤D中得到的转基因植株置于42°C下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。所述平邑甜茶的组织培养苗可以按照以下步骤得到初春采平邑甜茶一年生枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0. 的升汞(HgCl2)处理6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上；在接种后的第二天开始有部分材料开始褐化，一旦发现有褐化的材料，马上更换为新的初代培养基， 直到褐化消除；接种10天时，饱满的芽都开始萌发，40天时长成约4cm左右的组培苗。所述将植物表达载体pl21-Cre-Gus转化根癌农杆菌LBA4404可以按照以下步骤操作a.分别取5-10 μ L的载体pl21-Cre_Gus和100 μ L根癌农杆菌感受态LBA4404加在1. 5uL的离心管中，混勻，冰上放置30分钟；b.液氮中速冻2-3分钟，37°C水浴3分钟；c.再加入800LB液体培养基(不含抗生素)，在条件下，180转培养2_4小时；d.然后5000转/分离心5分钟，离心管底部留IOOuL,混勻涂布在含IOOmg · L—1卡那霉素的LB固体培养基上；e.挑出长出的单菌落，经PCR鉴定为阳性的根癌农杆菌LBA4404即可转化植物材料。所述LB液体培养基为IOmg化―1蛋白胨、5mg化―1酵母提取物、IOmg -L^1NaCl,pH7. 0的培养基。所述LB固体培养基为IOmg · L—1蛋白胨、5mg · L—1酵母提取物、IOmg · L^1NaCl, 6. 5mg · Γ1琼脂粉，pH7. 0的培养基。所述初代培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、1.Omg · L、-苄基腺嘌呤(6-benzyladenine)和 0. 2mg · Γ1 吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)，pH5.6的培养基。所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、 0. 3mg · L、-苄基腺嘌呤和 0. Img · Γ1 萘乙酸(naphthalene-acetic acid)，ρΗ5· 6 的培养基；所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、2.Omg · L-1N-苯基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1 吲哚丁酸，ρΗ5· 6 的培养基；所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、 300mg · Γ1头孢霉素、5mg · Γ1卡那霉素、2. Omg · Ι^Ν-苯基-N，-1，2，3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培养基；所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉和 0. 4mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培养基。所述MS基本培养基的配方如下，其中各组分单位为mg · L—1 权利要求1.，其特征在于，步骤如下A.构建植物表达载体pl21-Cre-Gus，转化根癌农杆菌LBA4404，在观°C下在含 IOOmg · Γ1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；B.将平邑甜茶的组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0. Icm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg· Γ1头孢霉素的分化培养基上， 在温度(25士 1) ！下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为 30 μ mol · πΓ2 · s—1的条件下再培养30天，获得转化芽；D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8 小时黑暗、光照强度为30 μ mol · m_2 · s—1的条件下培养40天，即可完成生根；E.取步骤D中得到的转基因植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定；F.将步骤D中得到的转基因植株置于42°C下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步 PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株；所述植物表达载体pl21-Cre-Gus的序列如序列表SEQ ID :No. 1所示；所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、 0. 3mg · ^6-苄基腺嘌呤和0. Img · L—1萘乙酸，pH5. 6的培养基；所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1琼脂粉、 2. Omg · L-1N-苯基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1 吲哚丁酸，ρΗ5· 6 的培养基；所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5m本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其特征在于，步骤如下：Ａ．构建植物表达载体ｐ１２１－Ｃｒｅ－Ｇｕｓ，转化根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，在２８℃下在含１００ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素的ＬＢ液体培养基中培养１６小时；Ｂ．将平邑甜茶的组织培养苗在继代培养基上培养３５天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约０．１ｃｍ２的叶盘，放在步骤Ａ得到的培养物中５分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下１天；Ｃ．将经过步骤Ｂ培养的平邑甜茶叶盘转接在含３００ｍｇ·Ｌ－１头孢霉素的分化培养基上，在温度（２５±１）℃下暗培养１４天，然后置于光周期为１６小时光照／８小时黑暗、光照强度为３０μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１的条件下再培养３０天，获得转化芽；Ｄ．将步骤Ｃ中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为１６小时光照／８小时黑暗、光照强度为３０μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１的条件下培养４０天，即可完成生根；Ｅ．取步骤Ｄ中得到的转基因植株的幼叶进行ＰＣＲ和ＧＵＳ鉴定；Ｆ．将步骤Ｄ中得到的转基因植株置于４２℃下热处理１５分钟，再取其幼叶进行进一步ＰＣＲ鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株；所述植物表达载体ｐ１２１－Ｃｒｅ－Ｇｕｓ的序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ：Ｎｏ．１所示；所述继代培养基为在ＭＳ基本培养基中附加３０ｍｇ·Ｌ－１蔗糖、６．５ｍｇ·Ｌ－１琼脂粉、０．３ｍｇ·Ｌ－１６－苄基腺嘌呤和０．１ｍｇ·Ｌ－１萘乙酸，ｐＨ５．６的培养基；所述再生培养基为在ＭＳ基本培养基中附加３０ｍｇ·Ｌ－１蔗糖、６．５ｍｇ·Ｌ－１琼脂粉、２．０ｍｇ·Ｌ－１Ｎ－苯基－Ｎ’－１，２，３－噻二唑－５－脲和０．２ｍｇ·Ｌ－１吲哚丁酸，ｐＨ５．６的培养基；所述分化培养基为在ＭＳ基本培养基中附加３０ｍｇ·Ｌ－１蔗糖、６．５ｍｇ·Ｌ－１琼脂粉、３００ｍｇ·Ｌ－１头孢霉素、５ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素、２．０ｍｇ·Ｌ－１Ｎ－苯基－Ｎ’－１，２，３－噻二唑－５－脲和０．２ｍｇ·Ｌ－１吲哚丁酸，ｐＨ５．６的培养基；所述生根培养基为在ＭＳ基本培养基中附加３０ｍｇ·Ｌ－１蔗糖、６．５ｍｇ·Ｌ－１琼脂粉和０．４ｍｇ·Ｌ－１吲哚丁酸，ｐＨ５．６的培养基。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金万梅，王媛花，张强，刘松忠，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。