本发明专利技术公开了一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用。本发明专利技术提供了酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)T43?CGMCC?No.4642。酿酒酵母T43具有广泛的温度适应性(可降低发酵过程中的冷却和加热成本)，对纤维素水解液中的抑制物有较高的耐受性(可简化生产工艺，缩短发酵时间)，具有很好的工业化应用前景，可实现玉米秸秆水解液中葡萄糖向乙醇的高效转化，直接应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中。本发明专利技术有助于在较高温度下启动酵母菌发酵纤维素水解物产乙醇，最终实现纤维素乙醇生产中酵母发酵层面的低能耗、低消耗、低成本和乙醇高产率，产生巨大经济效益的同时，也带来良好的社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株，具体涉及该菌株在乙醇发酵、特别是纤维素乙醇发酵中的应用。
技术介绍
当前，由于石油、天然气和煤炭等化石能源用量的急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。近年来，以淀粉质或糖质为原料生产燃料乙醇发展迅速，一定程度缓解了能源紧缺，但却引发了粮食安全问题。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。酿酒酵母是以糖质和淀粉质为原料的乙醇发酵最经典的优势菌株，利用酿酒酵母发酵纤维素水解物生产乙醇可以很好地与以甘蔗糖和淀粉为底物的乙醇发酵工艺整合，降低纤维素乙醇的生产成本。但酿酒酵母应用于发酵木质纤维素水解物生产乙醇方面还存在一些亟待解决的问题，目前利用纤维素酶降解木质纤维素为可发酵糖的过程通常是在比较高的温度下(50°C左右)进行的，而目前使用的酵母菌在30°C才有比较好的发酵活性，高温条件下酵母细胞没有活性，甚至死亡，因此需要一定时间的冷却，才能进行酵母菌的发酵； 木质纤维素降解为可发酵糖的过程中，以及微生物发酵过程中均会产生许多抑制微生物生长和发酵的物质，如乙酸、乙醇、糠醛等，酿酒酵母不能利用纤维素水解液中的五碳糖，严重影响细胞活性和乙醇产率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用。本专利技术提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为1^43，是将酵母菌株 R8-10-2进行离子束诱变、原生质体融合及基因组改组得到的，已于2011年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No. 4642。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) T43 CGMCC No. 4642 简称酿酒酵母 T43。本专利技术提供的酿酒酵母T43 最高生长温度为44°C，具有比较宽的温度适应范围， 在30-40°C有较高的乙醇产率；具有良好的抑制物耐受性，在40°C时能够耐受0.4% (体积百分比)乙酸、0.2% (质量百分含量)糠醛和14%乙醇(体积百分比)。本专利技术提供的酿酒酵母T43可用于酒精发酵。在40°C、培养基含0. 5% (体积百分比)乙酸条件下，用酿酒酵母T43发酵200g/L葡萄糖，糖利用率为95. 2%，乙醇产量为 85. 8g/L，糖醇转化率为96. 2 %。用酿酒酵母T43在40°C发酵玉米秸秆水解液，消耗106. 2g/ L葡萄糖，产生47. 9g/L乙醇，糖醇转化率为96. 4%。酿酒酵母T43的发酵培养基也属于本专利技术的保护范围；每升所述发酵所用的培养基可包括如下物质5-10g酵母粉，2-6g尿素，0. 5-lg磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g 氯化钙，总还原糖含量为100-200g(其中葡萄糖含量为80-160g)的玉米秸秆水解液。每升所述发酵培养基(PH自然)具体可由如下物质组成5g酵母粉，5g尿素，Ig磷酸二氢钾， 1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖含量为140g(其中葡萄糖含量为IlOg)的玉米秸秆水解液，其余为水。本专利技术还保护一种制备酿酒酵母T43的种子液的方法，包括如下步骤(1)将酿酒酵母T4328-37°C振荡培养14_20小时，得到液体菌种；(2)将所述液体菌种转接后振荡培养14-20小时，得到一级种子培养液；(3)将所述一级种子培养液转接后28-37°C搅拌培养14_20小时，溶氧控制在 3-%ig/L，得到种子液。所述步骤O)中，所述液体菌种可转接入如下培养基(pH自然)每升由如下组分组成5g酵母粉，IOg蛋白胨，5g尿素，Ig磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖含量为50g的玉米秸秆水解液(其中葡萄糖含量为39. 3g)，其余为水。所述步骤(3)中，所述一级种子培养液可转接入如下培养基(pH自然)每升由如下组分组成5g酵母粉，IOg蛋白胨，5g尿素，Ig磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖含量为75g的玉米秸秆水解液(其中葡萄糖含量为58. 9g)，其余为水。所述方法得到的种子液也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种生产乙醇的方法，是发酵酿酒酵母T43得到乙醇。所述发酵的条件可为30-40°C、20-36小时，溶氧为0. 2-0. 5mg/L。所述发酵的条件优选为30-40°C、36小时，溶氧为0. 3mg/L0所述发酵的底物可为玉米秸秆水解液。所述方法中，具体可将所述种子液接种至所述发酵培养基进行所述发酵。实验证明在40°C条件下，酿酒酵母T43发酵总还原糖含量为140g(其中葡萄糖含量为IlOg)的玉米秸秆水解液36小时，每升发酵醪可以产生46. 7g的乙醇，葡萄糖利用率为95.7%，糖醇转化率为96 %。本专利技术利用新的基因组改组策略提高了酿酒酵母对多重胁迫的耐受性，获得了一株遗传稳定的酿酒酵母重组菌。本专利技术提供重组菌能够在40°C发酵纤维素水解液，实现水解液中葡萄糖向乙醇的高效转化，可直接应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中。本专利技术提供的重组菌能够适应较宽的发酵温度范围(30-40°C)，可以降低发酵过程中的冷却成本，对纤维素水解液中抑制物具有较高的耐受性，可以简化生产工艺，缩短发酵时间，具有很好的工业化应用前景。本专利技术有助于在较高温度下启动酵母菌发酵纤维素水解物产乙醇，最终实现纤维素乙醇生产中酵母发酵层面的低能耗、低消耗、低成本和乙醇高产率，产生巨大经济效益的同时，也带来良好的社会效益。附图说明图1为实施例2中酿酒酵母T43的发酵结果；实心符号为发酵液中乙醇浓度(也称乙醇产量或乙醇含量)，空心符号为发酵液中葡萄糖含量(也称葡萄糖浓度)；( 和〇) 表示30°C，(■和□)表示37°C，(▲和Δ)表示40°C，( 和 )表示42°C。图2为实施例3中酿酒酵母T43的发酵结果；〇表示生物量，Δ表示发酵液中葡萄糖含量(也称葡萄糖浓度)，■表示发酵液中乙醇含量(也称乙醇产量)。图3为实施例4中酿酒酵母Τ43的发酵结果；Δ表示发酵液中总糖浓度(也称总糖含量)，▲表示发酵液中葡萄糖浓度(也称葡萄糖含量)，■表示发酵液中乙醇浓度(也称乙醇产量)。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。YPD培养基将20g蛋白胨，IOg酵母粉，20g葡萄糖用水定容至1升。乙醇发酵培养基EFM(自然pH) :6g酵母粉、IOg蛋白胨、5g尿素、Ig磷酸二氢钾、 1. 5g七水硫酸镁、0. 5g氯化钙和200g葡萄糖，溶于水，定容至1升。YEPD液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔ４３，其保藏编号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４６４２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何秀萍，程艳飞，郭雪娜，卢莹，张博润，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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