一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，通过以下步骤实现：设计与合成密码子优化后的融合基因序列，DNA疫苗的构建和体外表达能力测定。本发明专利技术以AE重组亚型HIV-1病毒为研究对象，构建包括env、pol、gag、tat、nef和rev基因在内的DNA疫苗，与AE-TRIVN相比，AE-Gp145TRN能够使特异性T细胞反应在Tat、Rev、Nef三个蛋白间更均匀的分布，提高了疫苗所活化的免疫反应广度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法。
技术介绍
HIV/AIDS是目前全人类共同面对的最严重的公共卫生问题之一。目前全球现存的HIV病毒携带者约为3060万 3610万人；另据我国卫生部统计数据显示截止2007年底，中国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万(55万 85万人)，其中艾滋病病人8. 5万 (8万 9万人)。在经过了近25年的研究之后，人类对艾滋病病毒的认识已经取得了长足的进步， 例如在致病机理方面，人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因结构和编码蛋白相继被阐明，病毒的受体和辅助受体相继被发现；在药物治疗方面，核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)相继研制成功，并应用于临床，取得了良好效果，等等。尽管如此，我们离真正克服艾滋病还有很长一段距离，而造成这一局面的重要原因之一就是HIV病毒的迅速变异。HIV病毒的迅速变异导致了多种不同亚型和重组流行株出现，并且这些亚型和重组株在全球呈现不均勻分布，这在客观上给HIV疫苗的研究带来了极大的困难。在研制出具有广泛交叉保护能力的“理想"HIV疫苗之前，根据特定地区的HIV-I优势流行亚型，有针对性的设计疫苗不失为一个合理的选择。此外，以往的HIV疫苗研究经验提示我们特异性免疫反应的广度对HIV疫苗的保护效果十分重要，而提高疫苗免疫反应广度的重要手段之一便是增加疫苗所包含的抗原种类。就HIV-I而言，理想的疫苗不仅要包括feg、P0l、Env 三个结构蛋白，还应包括Tat、Nef、Rev等调节蛋白。近年来，特别是在Merck疫苗三期临床试验失败后，由多个病毒抗原基因联合构成免疫原的疫苗设计策略在国际上逐渐兴起，国内这方面研究开展较少，尤其是针对HIV-I AE重组亚型病毒的疫苗研究尚处于空白阶段。在HIV-I疫苗研制上，针对HIV-I胞膜蛋白Env的疫苗已有较多研究，但是已有的针对HIV -1胞膜蛋白Env疫苗尚不能十分有效的诱导中和抗体。最近，许多研究转向了研制针对HIV-I病毒相对比较保守结构蛋白gag和调节蛋白tat的疫苗上，Gag蛋白表面富含CTL表位和T辅助细胞表位，以其为靶蛋白开发的DNA疫苗能诱发有效的中和抗体和CTL 反应，且可能对不同亚型病毒产生交叉保护，因而成为目前HIV疫苗研究的热点之一。HIV Tat蛋白亦是HIV较为保守的蛋白，在病毒感染早期表达，并对病毒生活周期是必需的，Tat 蛋白增加HIV病毒在体内传播的速度，对Tat蛋白高水平的体液和细胞免疫与良好的预后呈正相关，Tat疫苗所诱导的抗体能中和胞外Tat对机体各系统的损害，控制AIDS相关疾病的发生。最近Rezza等通过对252只感染HIV-I猴子的动物试验观察，发现高水平的 anti-Tat抗体伴随HIV长期非进展性感染(long-term nonprogression)，而anti-Tat抗体阴性的动物则很快进展为免疫缺陷。针对Nef、Rev、Pol等蛋白的单价疫苗亦有大量研究， 但效果均欠佳。于是有许多研究将重点放在了 HIV-I多基因融合DNA疫苗研制上，因为疫苗诱发的免疫反应的广度对HIV-I疫苗的保护效果有着深远的影响机体免疫系统所能识别的关键表位越多，病毒就越不容易逃逸。而现有的候选疫苗在抗原构成上多以HIV-I的结构蛋白为主，主要包含feg、Pol和Env;在调节蛋白中，通常仅包含Nef蛋白。从提高疫苗免疫反应广度的角度来看，这样的抗原构成是远远不够的，为了改善这一状况，很有必要构建HIV-I结构蛋白feig、Pol、Env与Tat、Nef、Rev调节蛋白基因的融合DNA疫苗并评价其免疫原性。我国是一个HIV-I多亚型平行流行的国家，流行病学调查显示，在我国HIV流行株中，AE重组亚型HIV-I是我国主要的HIV-I流行亚型之一，本研究拟以该亚型病毒研究对象，构建包括e/^、/7o入识仏iai、/^/和rer基因在内的DNA疫苗，并初步验证其免疫原性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，通过以下步骤实现(1)设计与合成密码子优化后的融合基因序列，(2)DNA疫苗的构建和体外表达能力测定A 重组质粒的酶切鉴定与测序将构建的重组质粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI进行双酶切，酶切产物进行W)琼脂糖凝胶电泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段长度为3423bp， 载体片段长度为5071 bp。电泳结果显示酶切结果与预期结果完全一致，结果见图1。DNA 双向序列测定结果显示插入序列与设计的序列完全一致；B TRIVN融合蛋白真核表达用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE-Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行 Western-Blot验证。在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。本专利技术用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE_Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行Western-Blot验证。在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。本专利技术Gpl45-Tat-Rev_Nef编码基因的密码子优化和基因合成是通过Los Alamos HIV Database调取HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在线软件，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化，在抗原基因密码子优化合成过程中，按照文献报道对2个基因分别进行了定点突变Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因简称为 AE-Gp145TRN。本专利技术按常规分子克隆方法将Ml I和EcoR V双酶切的tat-rev-integrase(c-h alf) -vif-nef基因连接入表达载体，通过限制性酶切和DNA测序的方法对所构建的质粒进行鉴定后，采用德国QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit试剂盒进行大量制备，制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中，pH7. 2，调整浓度为lmg/ml。本专利技术采用覆盖HIV-lAE2f亚型Env，Tat，Rev，htegrase，Vif和Nef全长蛋白的肽库来进行特异性T细胞反应检测。本专利技术以AE重组亚型HIV-I病毒为研究对象，构建包括env、pol、gag、tat、nef 和基因在内的DNA疫苗，与AE-TRIVN相比，AE_Gpl45TRN能够使特异性T细胞反应在Tat、Rev、Nef三个蛋白间更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反应广度。 附图说明图1是DNA疫苗AE-Gp 145TRN的酶切鉴定结果，1泳道为AE-Gp 145TRN的BamHI/ XbaI双酶切产物。图2重组质粒AE_Gpl45TRN的体外表达验证，1泳道为空载体对照，3泳道为 AE-Gpl45TRN的转染后产物，1泳道与3泳道的蛋白上样量基本一致。图3各组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＨＩＶ重组亚型ＤＮＡ疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（１）　设计与合成密码子优化后的融合基因序列，（２）　ＤＮＡ疫苗的构建和体外表达能力测定，Ａ：重组质粒的酶切鉴定与测序：将构建的重组质粒ＡＥ－Ｇｐ１４５ＴＲＮ用ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ进行双酶切，酶切产物进行ｌ％琼脂糖凝胶电泳，其中，Ｇｐ１４５ＴＲＮ融合基因的片段长度为３４２３ｂｐ，载体片段长度为５０７１　ｂｐ，电泳结果显示：酶切结果与预期结果完全一致，ＤＮＡ双向序列测定结果显示：插入序列与设计的序列完全一致；Ｂ：ＴＲＩＶＮ融合蛋白真核表达：用ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００将空载体质粒与重组质粒ＡＥ－Ｇｐ１４５ＴＲＮ分别转染２９３Ｔ细胞，培养４８　ｈ后收集细胞，并制备蛋白样品进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ验证，在各泳道上样量基本相当的情况下，Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ结果显示，重组质粒转染产物中出现约１９０ＫＤａ的特异性条带，与预期大小一致。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨益大，郑临，吕国才，谢珏，卢微，杨萍，王晓燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86