TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用，有助于提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，涉及TAp73基因的新应用，特别涉及TAP73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。例如，胶质瘤 (glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等) 引发的肿瘤，在颅内肿瘤中发病率位列第一，而且，因其呈浸润性无限制增生、与正常脑组织无明显界限并富含血管，还具有高复发率和低治愈率。目前对恶性肿瘤的治疗，主要采用手术治疗、放射治疗、化学治疗等相结合的综合治疗方式。尽管随着细胞毒性药物、分子靶向治疗药物、生物反应调节剂、肿瘤血管生成抑制剂等的迅猛发展，部分恶性肿瘤已能通过化学治疗治愈，但由于肿瘤耐药以及抗肿瘤药物本身毒副作用较大导致最大给药浓度较低等问题，化学治疗的疗效至今仍难以令人满意。其中，肿瘤耐药是目前化学治疗的主要障碍，也是困扰肿瘤临床治疗的关键性难题。因此，研究肿瘤耐药的产生与调控机制、发展新的耐药增敏剂是增强化疗药物疗效、提高肿瘤患者生命质量的重要策略。肿瘤干细胞(tumor stem cell，TSC)是肿瘤中一小部分具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的特殊细胞群体，通过不均一分裂能够产生与上一代完全相同的子代细胞及不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤，促成肿瘤的异质性和多样性。其与正常成体干细胞在功能上的差异主要反映在基因表达水平上。随着干细胞在肿瘤研究领域的不断深入，肿瘤干细胞是肿瘤发生、异常增殖、侵袭、转移、耐药以及复发的根源这个观点已得到普遍认同。根据肿瘤干细胞理论，文献报道的肿瘤耐药产生机制主要有两种(1)原发性耐药，由于肿瘤干细胞通常处于静止期、有较强的DNA修复能力、表达ABC转运蛋白而获得的与生俱来的耐药性，它不仅对作用于其本身的药物产生耐药性，而且对其它多种结构和作用机制迥异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性；(2)获得性耐药，长期暴露于辐射和/或致癌物后，肿瘤干细胞及与其相近的子代细胞可通过与正常干细胞积累突变的同样机制(点突变、基因激活、基因扩增等)而出现新的耐药性。由于肿瘤干细胞产生耐药的机制相当复杂， 针对肿瘤干细胞耐药机制的研究近年来已成为肿瘤研究领域的热点和难点。20世纪80年代至今，一直采用RESCIT评价实体瘤的疗效，该标准曾在临床中广泛发挥作用。但肿瘤干细胞在肿瘤组织中为数极少且具有超强耐药的特性，RESCIT标准难以评价出相应治疗对肿瘤干细胞的杀伤效果，而以减少肿瘤复发和转移、降低患者死亡率等指标作为肿瘤治疗的评价标准则更能反映肿瘤干细胞的治疗疗效。目前，很多治疗手段都能使肿瘤在短时间内得到控制和缩小，但多数患者会出现复发、转移，从而导致治疗失败。这种治疗模式的失败从另外一个角度也说明了肿瘤中存在极少数的能重建发展为肿瘤的干细胞。由于肿瘤的复发、转移和耐药等恶性表型都与肿瘤干细胞有关，因此，选择性地确认并杀死这些肿瘤干细胞是本领域技术人员希望达到的最终目标。p73基因作为第一个p53基因的类似物，于1997年在cos细胞中被偶然发现。其定位于1号染色体短臂(1ρ36. 2^36. 3)，全长221Λ，含14个外显子，表达产物可因羧基端或氨基端的选择性剪切而产生不同的亚型，分别为TAp73和DNp73。其中，TAp73 cDNA(GenBank 登录号NM_005427)全长^45bp，主要由转录激活区、DNA结合区和寡聚区组成，编码由636 个氨基酸组成的TAp73(NCBI登录号NP_005418. 1 )，能够诱导不可逆的细胞周期停滞、促进细胞凋亡。但TAp73基因在肿瘤干细胞中的表达与功能活性，如TAp73基因的表达水平在肿瘤干细胞与肿瘤细胞中有无显著性差异等都未见文献报道，因此，TAp73基因是否能够增强肿瘤干细胞的化疗敏感性还有待深入研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于通过考察TAp73基因在肿瘤干细胞中的表达与功能活性，确认TAp73基因是否能够增强肿瘤干细胞的化疗敏感性，用于制备肿瘤干细胞化疗增敏药物，从而增强肿瘤的临床治疗效果、提高肿瘤患者的生命质量。为达到上述目的，专利技术人考察了 TAp73基因在胶质瘤干细胞中的表达与功能活性，结果发现，TAp73在胶质瘤干细胞中的表达显著低于胶质瘤细胞，胶质瘤干细胞的耐药性显著高于胶质瘤细胞，TAp73表达与胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的耐药性均呈显著负相关；通过siRNA干扰，可以成功下调胶质瘤细胞中TAp73的表达，细胞耐药性明显增强；通过TAp73重组质粒转染，能够成功上调胶质瘤干细胞中TAp73的表达，细胞耐药性明显降低。由于脑胶质瘤是最常见的成人颅内恶性肿瘤，具有高复发率和低治愈率，且死亡率和致残率均很高。因此，对其耐药机制和基因靶向治疗进行的研究可作为其它肿瘤的实验依据和理论参考。同时，根据细胞表面的某些特异性标记，一些实体瘤的肿瘤干细胞也陆续被鉴定出来，如乳腺癌、脑肿瘤、肺腺癌、视网膜母细胞瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌等，这些肿瘤干细胞的共同特点是均具有自我更新、增殖和自我分化的能力，都能导致体内成瘤性，都对各种化疗药物表现出不同程度的耐药。因此，根据本专利技术的记载和本领域的公知常识，本领域技术人员可以推测出TAp73基因同样对除胶质瘤干细胞以外的其它肿瘤干细胞的化疗具有增敏作用。TAp73基因重组表达载体例如本申请中构建的TAp73-p⑶NA3. Imyc/ his a(-)重组表达载体可以单独或与其它具有功能活性的基因重组表达载体联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备肿瘤干细胞化疗增敏的药物。进一步，根据本专利技术的记载和本领域的公知常识，本领域技术人员还可以推测出 TAp73基因编码蛋白质以及包含TAp73基因编码蛋白质的融合蛋白都可以单独或与其它具有功能活性的多肽、蛋白质、融合蛋白等联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备肿瘤干细胞例如胶质瘤干细胞的化疗增敏药物。本专利技术的有益效果在于本专利技术首次公开了 TAp73基因可以用于制备肿瘤干细胞化疗增敏药物，有助于提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。附图说明图1显示了无血清培养前(A)和无血清培养后(B) OT133阳性细胞的比率。图2显示了临床分离培养的原代胶质瘤细胞(A)，经无血清培养后形成的胶质瘤干细胞球(B、C)以及胶质瘤干细胞球中存在的CD133阳性细胞(D为细胞核染色，蓝色荧光； E为OT133阳性细胞标记，红色荧光；F为D和E的融合)。图3显示了胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的表达(A)，经顺钼处理后胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的表达(B)以及胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对顺钼的耐药性(C)。图4显示了 TAp73表达量与耐药性的相关性，其中A为胶质瘤细胞，B为经顺钼处理的胶质瘤细胞，C为胶质瘤干细胞，D为经顺钼处理的胶质瘤干细胞。图5显示了胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的基因表达水平，其中WT为未转染组，Mock为空质粒转染组，siR为pGCsi/TO/TAp73 siRNA重组质粒转染组，TAp73为 TAp73-pCDNA3. lmyc/his a(-)重组质粒转染组。图6显示了改本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．ＴＡｐ７３基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用。2.根据权利要求1所述的TAp73基因的应用，其特征在于所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞。3.根据权利要求1所述的TAp73基因的应用，其特征在于所述肿瘤干细胞化疗增敏药物包括TAp73基因重组表达载体和药学上可接受的载体。4.根据权利要求1所述的TAp73基因的应用，其特征在于所述TAp73基因重组表达载体是将TAp73基因插入真核表达载体ρ⑶NA3. lmyc/his a(-)的多克隆位点中而得到。5.TAp73基因编码蛋白质在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用。6.根据权利要求5所述的TAp73基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑鸿，夏培元，王显凤，孙凤军，刘耀，杨波，刘芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85