本发明专利技术公开了一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂。本发明专利技术通过以基因芯片为基础，PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、且易于推广的检测方法，将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当目的片段被固相载体上的探针识别后，能够进行核酸序列的合成延长，使得被生物素标记的扩增片段固定在检测阵列上而不被洗脱，进而显色显示，一次就可以检测出待检测乙肝病毒的基因型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验领域，涉及乙型肝炎病毒基因的分型检测，特别涉及。
技术介绍
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，我国的乙型肝炎肝炎病毒携带者和患者共计约9300万，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。被HBV感染后，能逐渐演变为更为严重的肝病，如肝硬化、肝癌等，由此导致的死亡人数每年达50万。近年来的研究表明由基因突变导致的不同的HBV基因型，呈地理区域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有密切的关系。然而目前缺乏有效而准确的检测方法来对HBV进行早期的检测与分型，这种技术上的缺失给HBV的早期治疗和术后检查带来了许多不便。目前的乙型肝炎分型方法有很多，主要是针对基因突变所引起的差别的检查。当前的分型方法包括全基因测序、表面抗原基因(S基因)序列分析、聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型、单克隆抗体酶联免疫吸附试验基因分型法、特异性引物-PCR法、PCR微板核酸杂交-ELISA法、线性探针分析(LiPA)基因分型法、实时定量PCR 一解链曲线分析(Real-time PCR and melting curve analysis)。但是这些方法对于医疗系统而言，都存在着不同程度的难以普及性、成本昂贵以及周期长的问题。所以，在目前的医疗系统中，对乙型肝炎患者常规下仅作感染性检查，极少采用分型检测，对该病的早期诊断、预后检查以及个体化用药均甚为不利。基因芯片作为近年出现的兼具快速和通量高优点的检测工具，结合了测序原理， 是通过在固相载体上固定具针对性的核酸探针或蛋白质，进而与检测组分杂交结合，后引入发光信号(如荧光、生物素、放射性同位素等)进行分析检测来分析样品。但目前核酸杂交芯片配备设备复杂、昂贵，加之同时存在假阴性、假阳性率，故核酸分子基因芯片的质量控制难以被掌握。固相PCR技术是利用PCR原理，在固相载体上如毛细管、硅胶片、磁珠、玻璃片上等固定修饰的特异性引物进行PCR反应，其特点是反应简单，准确性高。但就实际操作而言， 对于引物修饰及固定需要较为复杂的化学处理，如在硅胶片或毛细管上不仅需要对载体表面处理，同时需要对探针或引物进行修饰，以及同固相载体的配套的PCR仪器并不能推广应用，这样不仅使得制作程序复杂，同时引起实验重复性降低，导致常规固相PCR只能在实验室环境下完成科研工作。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于提供，以基因芯片为基础进行通量检测，实现了高特异性且快速的对乙型肝炎病毒的基因分型和突变检测。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含 DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；所述的引物对的5、端增加生物素标记；所述的分型检测探针包括针对一个或多个基因型乙型肝炎病毒的检测探针，其长度为15 25nt，其中针对检测突变多态性的位点设置在探针5、端5nt之后，并在检测探针端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。所述的扩增引物所扩增的片段长度不超过IOOObp ；在检测探针上还加入PNA、LNA 或硫基提高检测特异性的修饰。针对A型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 2 ；针对B型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 3 SEQ IDNO 4 ；针对C型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 5 SEQ IDNO 6 ；针对D型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 7 SEQ IDNO 8 ；针对E型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 9 SEQ IDNO 10 ；针对F型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 11 SEQID NO 12 ；针对G型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 13 SEQID NO 14 ；针对H型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO 15 SEQID NO :16。所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5、端还被生物素标记。所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在分型检测探针5、端进行polyT、 polyC、polyT+polyC 或 spacer 6 15C 序列的延长修饰；所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，分型检测探针5、 端的辅助固定修饰为在分型检测探针5、最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。所述的亲和素反应液组成为ImL ddH20和2 μ 1亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为ImL显色缓冲液、6. 5 μ INBT和3. 5 μ 1 BCIP0一种基于上述试剂盒的乙型肝炎病毒基因分型的检测方法，包括以下步骤1)以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为A 在不低于探针Tm值5°C 的温度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循环数至少大于1 ；最后72°C延伸至少 3min ；3)固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH20冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH20终止反应；56)显色斑点所对应的分型结果即为所检测的乙型肝炎病毒的基因型，根据显色斑点与分型检测探针所针对的基因型，判定乙型肝炎病毒的基因型。所述的固相检测阵列在使用前还在体积浓度为2% 5%的BSA中37°C封闭至少 15min。所述的变性处理为热变性处理95 °C以上至少放置5min，再在0 °C至少放置 3min ；或者，所述的变性处理为碱变性处理将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1 10 20的体积比混合，放置至少;3min。所述的固相核酸扩增反应完成后，取出固相检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少Imin ；然后将固相检测阵列覆盖亲和反应液后37°C孵育至少 IOmin后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少Imin ；取出固相检测阵列用ddH20冲洗，最后覆盖显色反应液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；所述的洗脱液A 的组成为 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脱液 B 的组成为 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl0与现有技术相比，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，其特征在于，包括用于ＰＣＲ扩增乙型肝炎病毒基因Ｓ区和ＰｒｅＳ２区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含ＤＮＡ聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；所述的引物对的５｀端增加生物素标记；所述的分型检测探针包括针对一个或多个基因型乙型肝炎病毒的检测探针，其长度为１５～２５ｎｔ，其中针对检测突变多态性的位点设置在探针５｀端５ｎｔ之后，并在检测探针５｀端进行减少空间位阻的序列延长修饰和／或辅助固定修饰；所述的显色试剂包括含亲和素－碱性磷酸酶的亲和反应液和含ＮＢＴ／ＢＣＩＰ的显色反应液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：颜真，包晗，郭晏海，赵锦荣，汪钦，刘永兰，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87
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