使用非随机引物的CDNA合成制造技术

本发明专利技术提供了选择性扩增RNA模板分子群中的靶核酸分子群的方法(例如，除了最高表达的mRNA种类以外，细胞类型中表达的所有mRNA分子)。本发明专利技术还提供了包括SEQ?ID?NO：1-749中所示的核酸序列的第一寡核苷酸群，和包括SEQID?NO：750-1498中所示的核酸序列的第二寡核苷酸群。例如，第一寡核苷酸群可用于引发与从哺乳动物细胞分离的mRNA分子互补的第一链cDNA分子的合成，但不引发与核糖体RNA分子互补的cDNA分子的合成。第二寡核苷酸群可用于例如引发，与从哺乳动物细胞分离的mRNA分子互补的引物延伸产物(第一链cDNA)的第二链合成，但不引发从核糖体RNA分子合成的引物延伸产物的第二链合成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及选择性扩增靶核酸分子的方法和用于引发靶核酸分子的扩增的寡核 苷酸。
技术介绍
基因表达分析通常涉及起始核酸分子的扩增。可以分别或联合应用逆转录(RT)， 体外转录(IVT)或聚合酶链式反应(PCR)，进行核酸分子的扩增。起始核酸分子可以是mRNA 分子，其可以通过首先合成互补cDNA分子，然后合成与第一 cDNA分子互补的第二 cDNA分 子，从而产生双链cDNA分子来扩增。通常用逆转录酶进行第一链cDNA的合成，通常用DNA 聚合酶进行第二链cDNA的合成。通过使用RNA聚合酶，双链cDNA分子可用于产生互补的 RNA分子，从而扩增最初的起始mRNA分子。RNA聚合酶需要启动子序列以指导RNA合成的 起始。例如，互补的RNA分子可以用作模板来产生另外的互补DNA分子。可选地，例如双链 cDNA分子可以通过PCR来扩增，扩增的PCR产物可以用作测序模板或者用于微阵列分析。核酸分子的扩增需要使用与起始材料中一个或多个靶核酸分子特异性杂交的寡 核苷酸引物。每一寡核苷酸引物可以包括位于寡核苷酸的与靶核酸分子杂交的杂交部分的 5’端的启动子序列。如果寡核苷酸的杂交部分太短，那么寡核苷酸将不能稳定地与靶核酸 分子杂交，由此引发和随后的扩增将不能进行。同样，如果寡核苷酸的杂交部分太短，那么 寡核苷酸将不能与一个或少数靶核酸分子特异性杂交，而是与大量的靶核酸分子非特异性 杂交。不同靶核酸分子的复杂混合物(例如RNA分子)的扩增，通常需要使用具有不同 核酸序列的多种寡核苷酸的群体。寡核苷酸的成本随着寡核苷酸的长度增加。为了控制成 本，优选制备不长于确保寡核苷酸与靶序列特异性杂交所需的最小长度的寡核苷酸引物。通常不希望扩增高表达的RNA(例如核糖体RNA)。例如，在分析血细胞基因表达 的基因表达试验中，对大量拷贝的高丰度球蛋白mRNA或者核糖体RNA的扩增，可能会使稀 有mRNA的水平的微小变化不明显。因此，需要一组寡核苷酸引物，其选择性地扩增核酸分 子群内的期望的核酸分子(例如，选择性扩增在细胞中表达的、除最高表达的RNA以外的所 有mRNA的寡核苷酸引物)。为了降低合成寡核苷酸的群体的成本，每个寡核苷酸的杂交部 分应该不长于在确定条件下确保与期望的靶序列的特异性杂交所需的长度。专利技术概述在一个方面，本专利技术提供了在较大的非靶核酸分子群中，选择性扩增靶核酸分子 群(例如，除了最高表达的RNA种类以外，在细胞类型中表达的所有RNA分子)的方法。本 专利技术的该方面的方法均包括以下步骤(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群，从分离自 哺乳动物受试者的样品中的RNA模板分子群合成单链引物延伸产物群，其中第一寡核苷酸 引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分，其中RNA模 板分子群包括靶核酸分子群和非靶核酸分子群；(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群， 从步骤(a)的单链引物延伸产物群合成双链cDNA，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷 酸，包括由6，7或8个核苷酸组成的杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列，其中杂交部分选自具有6，7或8个核苷酸的长度，并且在确定的条件下不与合成的单链cDNA中的非 靶核酸分子群杂交的所有可能的寡核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸群中的每一 寡核苷酸包括随机杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列。另一方面，本专利技术提供了在较大的非靶核酸分子群中，选择性扩增靶核酸分子群 的方法。这方面，本专利技术的方法包括以下步骤(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群，从 分离自哺乳动物受试者的含总RNA的样品合成单链cDNA，其中第一寡核苷酸引物群中的每 一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分，其中杂交部分为包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成员；以及(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，从步骤 (a)合成的单链cDNA合成双链cDNA，其中第二寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸，包括杂 交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分，其中杂交部分为包含SEQ ID NO =750-1498 的寡核苷酸群的成员。另一方面，本专利技术提供了用于转录组特征谱分析的方法。这方面，本专利技术的方法包 括(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群，从分离自受试者的样品中的RNA模板分子群中 的靶核酸分子群合成单链引物延伸产物群，其中所述第一寡核苷酸引物群包含杂交部分和 位于杂交部分5’端的第一 PCR引物结合位点，(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群， 从步骤(a)的单链引物延伸产物群合成双链cDNA，其中所述第二寡核苷酸引物群包含杂交 部分和位于杂交部分5’端的第二 PCR引物结合位点，以及(c)用结合第一 PCR引物结合 位点的第一 PCR引物和结合第二 PCR引物结合位点的第二 PCR引物，对步骤(b)产生的双 链cDNA进行PCR扩增，其中非靶核酸分子群基本上由与哺乳动物受试者相同物种的核糖体 RNA和线粒体核糖体RNA组成。另一方面，本专利技术提供了包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群。例如，这些寡核苷 酸可用于引发与分离自哺乳动物受试者的RNA分子互补的第一链cDNA分子的合成，而不引 发与核糖体RNA(18SJ8S)或线粒体核糖体RNA (12S，16S)分子互补的第一链cDNA分子的 合成。在某些实施方案中，寡核苷酸群中的每一寡核苷酸进一步包括位于杂交部分5’端的 确定序列部分。在一个实施方案中，确定序列部分包括转录启动子，其在PCR扩增中用作引 物结合位点或用于体外转录。在另一实施方案中，确定序列部分包括其不是转录启动子的 引物结合位点。例如，在一些实施方案中，本专利技术提供了寡核苷酸群，其中转录启动子例如 T7启动子(SEQ ID NO :1508)，位于具有SEQ ID NO :1-749中所示的序列的寡核苷酸群的成 员的5'端。因此，在一些实施方案中，本专利技术提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于 具有SEQ ID NO :1-749中所示序列的寡核苷酸群的不同成员的5'端的T7启动子(SEQ ID NO 1508)所组成。在进一步的实施方案中，本专利技术提供了寡核苷酸群，其中确定序列部分 包括用于引发PCR合成反应但不包含RNA聚合酶启动子序列的至少一个引物结合位点。用 于此类实施方案的确定序列部分的代表性实例为5' TCCGATCTCT3' (SEQ ID NO :1499)， 其优选位于具有SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的成员的5'端。另一方面，本专利技术提供了包含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群。例如，这些寡 核苷酸可用于引发与从分离自哺乳动物受试者的RNA合成的第一链cDNA分子互补的第二 链cDNA分子的合成，而不引发与逆转录自核糖体RNA (18S，28S)或线粒体核糖体RNA (12S， 16S)分子的第一链cDNA互补的第二链cDNA分子的合成。在一些实施方案中，寡核苷酸群 中的每一寡核苷酸进一步包括位于杂交部分5’端的确定序列部分。在一个实施方案中，确定序列部分包括转录启动子，其可在PCR扩增中用作引物结合位点或用于体外转录。在另 一实施方案中，确定序列部分包括其不是转录启本文档来自技高网...

【技术保护点】
其中要求专有所有权或特权的本专利技术的实施方案定义如下：１．在ＲＮＡ模板分子群中选择性扩增靶核酸分子群的方法，所述方法包括以下步骤：（ａ）提供用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群从分离自哺乳动物受试者的样品中的ＲＮＡ模板分子群合成的单链引物延伸产物群，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分５’端的确定序列部分，其中ＲＮＡ模板分子群包括靶核酸分子群和非靶核酸分子群；和（ｂ）用ＤＮＡ聚合酶和第二寡核苷酸引物群，从步骤（ａ）的单链引物延伸产物群合成双链ｃＤＮＡ，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由６，７或８个核苷酸组成的杂交部分和位于杂交部分５’端的确定序列部分，其中杂交部分选自具有６，７或８个核苷酸的长度，并且在确定的条件下与靶核酸分子群杂交，而在确定的条件下不与单链引物延伸产物群中的非靶核酸分子群杂交的所有可能的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.10.26 US 60/983,085其中要求专有所有权或特权的本发明的实施方案定义如下1.在RNA模板分子群中选择性扩增靶核酸分子群的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群从分离自哺乳动物受试者的样品中的RNA 模板分子群合成的单链引物延伸产物群，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括 杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分，其中RNA模板分子群包括靶核酸分子群和 非靶核酸分子群；和(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，从步骤(a)的单链引物延伸产物群合成双链 cDNA，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由6，7或8个核苷酸组成的杂交部分和 位于杂交部分5’端的确定序列部分，其中杂交部分选自具有6，7或8个核苷酸的长度，并 且在确定的条件下与靶核酸分子群杂交，而在确定的条件下不与单链引物延伸产物群中的 非靶核酸分子群杂交的所有可能的寡核苷酸。2.权利要求1的方法，其中第二寡核苷酸引物群的杂交部分经选择包括，在确定的条 件下不与单链引物延伸产物群中的非靶核酸群杂交的、长度为6个核苷酸的所有可能的寡 核苷酸。3.权利要求1的方法，其中非靶核酸分子群基本上由RNA模板分子群中最高丰度的核 酸分子组成。4.权利要求3的方法，其中最高丰度的核酸分子选自核糖体RNA，线粒体核糖体RNA，及 其组合。5.权利要求1的方法，其中第一寡核苷酸群的杂交部分由6，7，8，或9个随机核苷酸中 的一种组成，并且所述确定序列部分包括用于PCR扩增的第一引物结合位点。6.权利要求1的方法，其中第一寡核苷酸引物群的杂交部分群选自，在确定的条件下 不与RNA模板分子群中的非靶核酸分子杂交的、长度为6个核苷酸的所有可能的寡核苷酸。7.权利要求1的方法，其中样品包括总RNA。8.权利要求1的方法，其中第一和第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸的确定序列部 分，由长度范围在10个核苷酸至20个核苷酸的、用于PCR扩增的引物结合位点所组成。9.权利要求8的方法，其中第一或第二引物结合位点中的至少一个，包括转录启动子。10.权利要求1的方法，其中第二寡核苷酸群的每一寡核苷酸进一步包括，由1-10个 随机核苷酸组成的间隔子序列部分，其中所述间隔子部分位于确定序列部分和杂交部分之 间。11.权利要求1的方法，其中第二寡核苷酸群中的杂交部分群选自，包括SEQID NO 750-1498的寡核苷酸。12.权利要求6的方法，其中第一寡核苷酸群中的杂交部分群选自，包括SEQID NO 1-749的寡核苷酸。13.权利要求8的方法，进一步包括扩增双链cDNA的至少一个链。14.权利要求13的方法，进一步包括对PCR扩增的DNA进行测序。15.权利要求8的方法，其中第一群中每一寡核苷酸的确定序列部分包括至少8个连续 核苷酸的区域，所述区域与第二群中每一寡核苷酸的确定序列部分中的至少8个连续核苷 酸的区域相同。16.权利要求8的方法，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一个的确定序列部分，包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5 ‘端。17.分析转录组特征谱的方法，包括(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群，从分离自哺乳动物受试者的样品中的RNA模 板分子群中的靶核酸分子群合成单链引物延伸产物群，所述第一寡核苷酸引物群包括杂交 部分和位于杂交部分5’端的第一 PCR引物结合位点，(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，从步骤(a)生成的单链引物延伸产物群合成 双链cDNA，所述第二寡核苷酸引物群包括杂交部分和位于杂交部分5’端的第二 PCR引物结 合位点，其中杂交部分选自具有6个核苷酸的长度的，在确定的条件下与靶核酸分子群杂 交，而在确定的条件下不与单链引物延伸产物群中的非靶核酸分子群杂交的所有可能的寡 核苷酸，其中非靶核酸分子群基本上由与所述哺乳动物受试者相同物种的核糖体RNA和线 粒体核糖体RNA所组成，和(c)使用与第一PCR引物结合位点结合的第一 PCR引物和与第二 PCR引物结合位点结 合的第二 PCR引物，PCR扩增步骤(b)合成的双链cDNA。18.权利要求17的方法，进一步包括将PCR产物克隆入载体，以产生样品分离时哺乳动 物受试者的转录组的代表性文库。19.权利要求17的方法，进一步包括对至少一部分PCR产物测序。20.权利要求17的方法，其中PCR扩增使用退火温度在40-50度的至少2个扩增循环， 之后用退火温度大于50度的额外的扩增循环来进行。21.权利要求17的方法，进一步包括标记至少一部分扩增的PCR产物。22.权利要求17的方法，其中第一群中每一寡核苷酸的第一PCR引物结合位点，包括至 少8个连续核苷酸的区域，所述区域与第二寡核苷酸群中每一寡核苷酸的第二 PCR引物结 合位点中的至少8个连续核苷酸的区域相同。23.权利要求17的方法，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一个的PCR引物结合位点， 包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5‘端。24.用权利要求17的方法所产生的经扩增的核酸分子群。25.在较大的非靶核酸分子群中选择性扩增靶核酸分子群的方法，所述方法包括以下 步骤(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群，从分离自哺乳动物受试者的含总RNA的样品 合成单链cDNA，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分 5’端的确定序列部分，其中杂交部分为包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成员；和(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，从步骤(a)合成的单链cDNA合成双链cDNA， 其中第二寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序 列部分，其中杂交部分为包含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群的成员。26.权利要求25的方法，其中第一寡核苷酸引物群的杂交部分群，包括包含SEQID NO 1-749的寡核苷酸的至少10%。27.权利要求25的方法，其中第二寡核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·K·雷蒙德，C·阿穆尔，J·卡斯尔，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：US