本发明专利技术涉及一种生产甲萘醌-7的方法，其特征在于大肠杆菌菌株的细胞含有枯草芽孢杆菌DSM?1088?hepS基因、枯草芽孢杆菌DSM?1088hepT基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM?1088七异戊烯基转移酶(heptaprenyl?transferase)基因，这些细胞在发酵培养基中发酵，同时甲萘醌-7在发酵的大肠杆菌菌株的细胞中累积。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
甲萘醌-7是维生素K族的一部分。人体营养中的甲萘醌类主要来源于肠道细菌， 如嗜酸乳杆菌或大肠杆菌。从生物化学角度，甲萘醌类参与特定谷氨酸残基的羧化作用以产生Y-羧基谷氨酸(GLA)。一种主要的含有3个GLA残基的蛋白是骨钙素。骨钙素是在成骨细胞中形成的并构成了骨骼中15-20%的非胶原蛋白。维生素K的缺乏会导致进入血浆中的非羧化骨钙素，这成为骨代谢紊乱的一个重要指标。研究表明甲萘醌-7补充剂对人类既有促进骨形成的效果，又有预防动脉硬化的效果。例如，一项研究表明减少维生素K的摄入与骨密度的降低和髋部骨折风险的增大相关(Feskanich et al.，1999，Am. J. Clin. Nutr. 69 :74-79)。另一项研究表明饮食中补充甲萘醌-7可以促进骨钙素的Y-羧化(Tsukamoto， 2004，BioFactors 22 :5-19)。通常，甲萘醌-7是用一种本来就含有较高含量的甲萘醌-7的枯草芽孢杆菌菌株生产的。在亚洲地区把这种菌株用于生产纳豆，因此这种菌株又称作纳豆枯草芽孢杆菌或纳豆杆菌(Earl et al.，2007，J. Bacteriol. 189 :1163-1170)。一种可能的生产甲萘醌-7的方法是利用纳豆枯草芽孢杆菌使大豆发酵，然后从纳豆中分离出甲萘醌_7。在EP 1803820B1中描述了将生产甲萘醌_7的枯草芽孢杆菌菌株的工业发酵作为可替代的生产方案的选择。接着所述菌株可以直接喷雾干燥，并作为含甲萘醌-7的生物物质出售。由于具有预防骨质疏松和动脉硬化的功能，含维生素K的食品增加。可以在食物中加入这种添加剂，如所描述的甲萘醌-4，或者食品中直接包含产生甲萘醌的乳酸菌(EP 1153M8B1和EP 2076585)。乳酸菌如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(乳脂亚种或乳酸亚种)或乳明串珠球菌(Leoconostoc lactis)主要生产甲萘醌_8和甲萘醌_9 (Morishita et al.，1999，J. Dairy Sci. 82 :1897-1903)。细菌通常产生具有不同长度的类异戊二烯链的甲萘醌类，并在一定程度上可以依据这种代谢物来进行分类学区分。正如前面所述，枯草芽孢杆菌主要用来生产甲萘醌_7。与枯草芽孢杆菌相比，在大肠杆菌中发现的甲萘醌类主要是甲萘醌-8和甲萘 Il -9 (Collins and Jones, 1981, Microbiological Reviews 45:316-354)。据了解，该类蛋白质所有的基因都参与大肠杆菌中甲萘醌的生物合成。从最初的代谢产物分支酸 (chorismate)开始，生物合成了一种色氨酸的中间体，和类异戊二烯类的主要代谢产物异戊二烯基焦磷酸酯(IPP)，最初的中间体1，4_ 二羟基-2-萘甲酸(DHNA)就产生了。这涉及到以下几种酶MenF (异分支酸合成酶)，MenD (2-琥珀酰-6-羟基_2，4-环己二烯-1-羧酸酯合成酶)，MenC(0-琥珀酰苯甲酸酯/盐合成酶(O-succinylbenzoatesynthase))， MenE (0-琥珀酰苯甲酸酯 / 盐-CoA连接酶(O-succinylbenzoate-CoA Iigase))和MenB (萘甲酸酯/盐-CoA合成酶)。由MenA编码的DNHA异戊烯转移酶将八异戊烯醇焦磷酸盐/酯 (octaprenyl pyrophosphate)单元转移到DHNA，同时释放出CO2和焦磷酸盐/酯。去甲基甲萘醌(DMK)就产生了。最后的生物合成步骤包括通过S-腺苷甲硫胺酸依赖的甲基转移酶，W^iE JfDMK甲基化并产生甲萘醌_8。八异戊烯醇焦磷酸盐/酯是由IPP用idi、ispA 和ispB基因编码的三种酶的协助下合成得到的。第一个合成步骤中，IPP通过异戊烯焦磷酸异构酶Idi被异构化；接着在两步IspA-催化的反应步骤中被拉长以生成C15单元。在下面的四步反应步骤中，所有都被IspB八异戊烯基合成酶催化，C40单元，八异戊烯醇焦磷酸盐被合成。枯草芽孢杆菌细菌能够实现相当量的甲萘醌类的生物合成。虽然七异戊烯基转移酶作为一种关键的酶可以将七异戊烯基单元转移到DHNA，但是这种酶既没有从基因上识别，也没有从生物化学角度描述。然而，甲萘醌-7生物合成基因的基因可获得性对于生产甲萘醌-7的大规模工业方法是必要的。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供一种利用大肠杆菌能够生产甲萘醌-7的方法。本专利技术的一个方面是提供一种生产甲萘醌-7的方法，其特征在于将含有枯草芽孢杆菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 1088七异戊烯基转移酶基因的大肠杆菌菌株的细胞在发酵培养基中发酵，同时甲萘醌-7 在发酵的大肠杆菌菌株细胞中累积。优选地，该方法其特征在于发酵之后，通过发酵培养基的离心以分离出细胞并随后从所述细胞中提取甲萘醌-7来分离甲萘醌_7，甲萘醌-7的层析提纯、浓缩、配制或复合。本专利技术的另一方面是提供一种利用大肠杆菌进行甲萘醌-7的工业生产的甲萘醌-7生产质粒，其特征在于含有枯草芽孢杆菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM1088七异戊烯基转移酶基因。优选地，该甲萘醌-7生产质粒，其特征在于含有同源启动子或异源启动子。优选地，该甲萘醌-7生产质粒，其特征在于所述异源启动子是大肠杆菌gapA基因的启动子或大肠杆菌tufB基因的启动子，或者是lac、tac、trc、λ、ara或tet启动子。优选地，该甲萘醌-7生产质粒，其特征在于含有操纵子的结构，在所述操纵子结构中枯草芽孢杆菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 1088七异戊烯基转移酶基因受大肠杆菌gapA启动子的控制。优选地，该甲萘醌-7生产质粒，其特征在于所使用的质粒是能够在大肠杆菌中染色体外复制并含有筛选标记的DNA分子。优选地，该甲萘醌-7生产质粒，其特征在于所使用的质粒在大肠杆菌中具有高的细胞拷贝数或在大肠杆菌中具有平均的拷贝数或在大肠杆菌中具有低的拷贝数。本专利技术的又一方面是提供一种大肠杆菌菌株，包含上述的质粒或枯草芽孢杆菌 DSM 1088hepS基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088hepT基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 1088七异戊烯基转移酶基因的多个染色体的拷贝。附图说明图1示意性地描述了本专利技术的操纵子构建体。是用于生产甲萘醌-7的操纵子的示意性代表图。gapAP =大肠杆菌W3110gapA启动子；RBS =核糖体结合位点；h印S =来自4DSM1088的h印S基因；h印T =来自DSM1088的h印T基因；HPT =假定的来自DSM1088的七异戊烯基转移酶基因；(a)、(b)、(c)和(d)=克隆元件。图2示意性地描述了质粒PKG82，其适于生产甲萘醌_7。具体实施例方式本专利技术的一个目的是提供一种利用大肠杆菌能够生产甲萘醌-7的方法。实现这个目的的方法具有以下特点包含枯草芽孢杆菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 10本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种生产甲萘醌－７的方法，其特征在于将含有枯草芽孢杆菌ＤＳＭ１０８８ｈｅｐＳ基因、枯草芽孢杆菌ＤＳＭ １０８８ｈｅｐＴ基因和假定的枯草芽孢杆菌ＤＳＭ １０８８七异戊烯基转移酶基因的大肠杆菌菌株的细胞在发酵培养基中发酵，同时甲萘醌－７在发酵的大肠杆菌菌株细胞中累积。
【技术特征摘要】
2010.02.11 DE 102010001832.51.一种生产甲萘醌-7的方法，其特征在于将含有枯草芽孢杆菌DSM1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 1088七异戊烯基转移酶基因的大肠杆菌菌株的细胞在发酵培养基中发酵，同时甲萘醌-7在发酵的大肠杆菌菌株细胞中累积。2.利用大肠杆菌进行甲萘醌-7的工业生产的甲萘醌-7生产质粒，其特征在于含有枯草芽孢杆菌DSM 1088h印S基因、枯草芽孢杆菌DSM 1088h印T基因和假定的枯草芽孢杆菌DSM 1088七异戊烯基转移酶基因。3.根据权利要求2所述的甲萘醌-7生产质粒，其特征在于含有同源启动子或异源启动子。4.根据权利要求3所述的甲萘醌-7生产质粒，其特征在于所述异源启动子是大肠杆菌 gapA基因的启动子或大肠杆菌tufB基因的启动子，或者是lac、tac、trc、λ、ara或tet启动子。5.根据权利要求2至4所述的甲萘醌...
【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·施勒泽尔，
申请(专利权)人：瓦克化学股份公司，
类型：发明
国别省市：DE
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