本发明专利技术公开了“细胞代谢物相对含量作为细胞数量指标进行数据校正的新方法”。其特征在于采用简便的样品前处理方法实现细胞内生化代谢的快速猝灭；通过优化提取溶剂以高效提取细胞内小分子代谢物；再利用基于质谱、核磁共振等测定技术的代谢组学方法全面、半定量测定生物样本中小分子化合物，鉴定出的细胞内标志性代谢物作为细胞数量的定量指标，以此作为权重因子进行数据校正。与现有细胞数量的定量指标相比，该方法简便、快捷、重现性好，减少了额外的实验工作和由此引入的误差，增强了实验结果的准确性和可靠性，解决了体外培养细胞数相对定量的难题，为细胞代谢组学和相关研究提供了一个新的替代方法，可广泛用于细胞分子生物学领域的相关研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用体外培养细胞进行疾病、药效、药物毒性等相关的代谢组学研究的新方法，具体涉及体外培养细胞生化代谢的快速猝灭、细胞内小分子化合物高效提取、细胞代谢物相对含量作为细胞数目定量指标并用于代谢组学数据校正的方法。
技术介绍
目前，细胞代谢组学研究的方法尚不成熟，尤其是体外培养的贴壁细胞的代谢组学研究相对滞后，存在一系列的问题，主要表现在以下三个方面：1.细胞数量定量问题 不同细胞增殖速度的差异，同种细胞受起始接种密度及不同处理方法(环境或药物刺激)的影响，会导致不同的细胞株或同种细胞株在不同状态下生长获得的细胞数目存在差异，在进行数据处理时需要对细胞数量差异进行校正。而目前普遍用于细胞数量校正的常用方法如细胞计数、细胞湿重称量、蛋白量测定等方法不仅费时、费力(如计数和细胞称重不仅需要进行额外实验，贴壁细胞在胰酶的消化作用下还不可避免地产生代谢谱的偏移；蛋白含量测定方法需要进行额外实验，同时还消耗数量本来就有限的细胞样品)，导致细胞内各种代谢物水平的变化，也延迟了细胞内生化代谢的猝灭，造成校正数据的偏差。2.提取效率问题 生物样本的前处理方法极大地影响代谢组学研究结果，特别是其中小分子化合物的提取方法直接影响细胞内小分子化合物的提取效率(回收率)和精密度(重复性)，从而对代谢组学结果产生影响。筛选合适的提取溶剂是稳定和充分地提取出细胞中的小分子代谢物的关键问题之一。3.细胞内生化代谢快速猝灭的问题 为了准确获得细胞中小分子化合物定量信息，需要快速猝灭活细胞中不断进行的生化代谢，否则容易导致细胞代谢谱的偏移，影响实验结果的可靠性。由于绝大多数体外培养细胞具有贴壁生长的特性，如何快速收获细胞并迅速进行代谢猝灭以供代谢组学分析也是关键问题。总之，现有的细胞代谢组学研究的方法局限性较大，一方面，现有的细胞数量校正方法操作繁琐，容易引起细胞内代谢物含量偏差，另一方面现有的贴壁培养的细胞前处理方法复杂、难以进行快速的代谢猝灭、容易引入系统误差，迫切需要创立新的研究方法。代谢猝灭越快，前处理步骤越简易，代谢组学的研究结果也就越可靠。考虑到细胞内的 代谢物水平应与细胞数量具有正相关性，寻找细胞内小分子代谢物替代蛋白量作为细胞数量的指标用于代谢组学数据的权重具有现实的可能性。研究表明，以GC/TOFMS测定为例，细胞内很多小分子代谢物包括几乎所有氨基酸、糖醇类化合物、脂肪酸类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物的相对含量与细胞数量/蛋白含量呈良好的线性相关。其中一些代谢物水平与细胞数量之间的相关性还显示出独立于细胞株的特性，即在不同细胞株中都具有线性相关性，如肌醇、泛酸、胆固醇等。这些潜在的标志性代谢物可能对多种细胞都具有很好的普适性，是细胞数量的候选标志物，有望用于替代蛋白量作为细-->胞数量的指标并用于相关实验数据的校正和分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：改进细胞代谢组学研究中现有的细胞收集和代谢猝灭方法，优化溶剂提取的方案，利用鉴定出的小分子代谢物作为细胞数目的指标用于所得数据的权重，解决细胞代谢组学研究中存在的一系列研究难题。为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案，步骤包括：样品收集和处理：细胞按照标准操作规程培养于细胞板或培养皿中，待细胞生长至合适数量，弃去培养基并用2.5mL的0.5℃生理盐水迅速淋洗细胞表面2次，然后向每份样品中加入合适体积的超纯水(根据所采用的培养器皿的大小和细胞数量来综合考虑)，再将样品迅速置于-70℃的冰箱中保存。细胞裂解悬液经反复冻融3次后加入适量的有机溶剂进行提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或经过蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包括加入有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)等单独或者综合的方式进行处理；样品可不进行干燥，或先干燥再利用各类含有机溶剂和水相(单独或者综合，含盐或者不含盐)的溶媒溶解；样品不进行衍生化或者利用试剂进行衍生化处理。样品分析和数据处理：采用基于质谱测定与色谱联用的技术方法或核磁共振技术的测定方法对上述样品进行检测，这些方法可以是液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳色谱-质谱、核磁共振等；经过数据处理后得到色谱图中各个峰的定量数据，这个数据可以是峰面积或峰高，或由峰面积或峰高计算得到的定量数据。本专利技术的一个突出优点是通过上述方法能简便迅速使细胞代谢猝灭，获得细胞即刻的代谢谱，保证了实验结果的准确性和可靠性，而且对样品进行一次测定即可获得细胞整体代谢谱和每个样本的校正/权重因子，该方法既简便快捷又避免额外实验(如细胞计数、蛋白浓度测定)所引入的系统误差和人为误差。本专利技术的有益效果：在体外培养细胞代谢组学研究中由于不能及时有效地进行代谢猝灭，往往会导致细胞代谢模式的改变，快速简便的样品处理方法包括有效的细胞收集及快速的代谢猝灭是保证研究结果准确、可靠的关键。此外现有的细胞计数、蛋白定量等作为细胞数量校正的方法操作繁琐，容易引起细胞内代谢物含量偏差，而利用细胞内标志性代谢物的方法简便、快捷，其数据校正效果与传统的校正因子(如蛋白含量、细胞计数)相当，显示出较大的优越性。1.利用改进的细胞前处理方法可以高效提取细胞内代谢物、有效进行代谢猝灭，一方面可以提高代谢物检测的准确性，防止代谢猝灭不完全造成的偏差；另一方面也简化了复杂的细胞收集、细胞代谢物提取的过程，减少了操作和系统误差。2.利用细胞内标志性代谢物作为细胞数量的权重因子用于细胞代谢组学研究可以简化实验操作，无需进行额外实验就可以获取权重因子，同时也减少测定误差和人为误差。3.采用细胞内标志性代谢物作为权重因子与蛋白含量相比，小分子代谢物含量测定的手段更加灵活多样，如LC-MS，GC-MS等，其检测的灵敏度、重现性和线性范围也大大提-->高。4.采用细胞内标志性代谢物与细胞计数或细胞称重相比，可以迅速猝灭细胞生化代谢，减少不必要的实验操作，增强结果的准确性和可靠性。附图说明图1马丁达比犬肾上皮细胞系(Madin-Darby canine kidney，MDCK)野生型(a，MDCK-WT)和转染人Mdr1基因的转染型(b，MDCK-MDR)的GC/TOFMS测定总离子流色谱图，色谱图中可以发现252个色谱峰，已经鉴定的化合物有94个。图2细胞数量的胞内标志性代谢物-苹果酸、肌醇、泛酸和胆固醇与蛋白含量之间的线性回归曲线A，D：MDCK-WT和MDCK-MDR细胞中的整合数据B，E：仅包括MDCK-WT细胞中的数据C，F：仅包括MDCK-MDR细胞中的数据图3细胞数量的胞外标志性代谢物-肌醇、丝氨酸和山梨醇与细胞数目/蛋白含量之间的线性回归曲线a：胞外标志性代谢物与蛋白含量之间的线性回归曲线b：胞外标志性代谢物与细胞数目之间的线性回归曲线图4不同数量细胞样品的代谢组学数据在权重前(A)和经蛋白含量(B)及鉴定出的细胞数目的标志性代谢物-泛酸(C)和肌醇(D)校正后的样品分布散点图。MDCK-WT和MDCK-MDR细胞的代谢谱随着细胞数量的不同呈动态变化的轨迹，而肌醇和泛酸权重后每种细胞在第1主成分和第2主成分上的差异均明显降低，组内散点更加聚集，表明权重有效地降低了细胞数量造成的代谢物水平差异，从而增加了模型的有效性，而本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种应用细胞内小分子代谢物作为细胞数目指标用于细胞代谢组学数据的权重，其特征包括以下几个方面：ａ）采用体外培养细胞样本进行检测；ｂ）采用反复冻融的方法破碎细胞，甲醇沉淀蛋白的方法对细胞中小分子进行提取；ｃ）采用三甲基硅烷基三氟乙酰ＭＳＴＦＡ的方法对样本进行衍生化；ｄ）采用气相色谱－飞行时间质谱（ＧＣ／ＴＯＦ－ＭＳ）进行样本分析；ｅ）采用细胞内肌醇、泛酸、胆固醇、苹果酸对代谢组学数据进行校正。ｆ）采用细胞培养液中肌醇、泛酸对代谢组学数据进行校正。
【技术特征摘要】
1.一种应用细胞内小分子代谢物作为细胞数目指标用于细胞代谢组学数据的权重，其特征包括以下几个方面：a)采用体外培养细胞样本进行检测；b)采用反复冻融的方法破碎细胞，甲醇沉淀蛋白的方法对细胞中小分子进行提取；c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法对样本进行衍生化；d)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)进行样本分析；e)采用细胞内肌醇、泛酸、胆固醇、苹果酸对代谢组学数据进行校正。f)采用细胞培养液中肌醇、泛酸对代谢组学数据进行校正。2.除权利要求1中的体外培养细胞样本外，还适用于其它培养细胞、原代细胞、原位组织细胞等。3.除权利要求1中作为代谢组学数据权重因子外，还适用于其它分子细胞生物实验数据的权重与分析。4.除权利要求1中反复冻融的方法破碎细胞外，还包括其它方法如超声破碎、高渗盐溶液、有机溶剂破碎的方法；除甲醇沉淀蛋白的方法提取细胞样本外，还包括经过其它蛋白沉淀方法，如加入有机溶剂(如乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)或经过有机溶剂进行液-液提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、苯、正己烷、环己烷、乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：王广基，阿基业，曹蓓，刘林生，石建，郑天，李梦婕，王新文，赵春艳，张凤逸，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84
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