四环素类抗生素在制备抗视网膜缺血损伤药物中的应用制造技术

四环素类抗生素在制备抗视网膜缺血损伤药物中的应用，对眼压升高引起的视网膜缺血损伤，缺血前或者缺血后腹腔注射四环素和强力霉素，均起到保护视网膜免受损伤的作用。组织化学技术分析表明，四环素和强力霉素可以分别使６１．８％和８０．０％的视网膜节细胞层神经元免于死亡，并使ＮＯＳ阳性细胞密度降至接近或达到正常值。本发明专利技术对挽救青光眼患者的视觉功能具有潜在的临床意义。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种广谱抗生素的新的用途，确切地说是四环素类抗生素在制备抗视网膜缺血损伤药物中的应用。视网膜缺血是造成视功能损害的主要原因之一。青光眼常伴有眼内压(下称眼压)急性或慢性升高，压迫血管导致视网膜缺血，随着时间的推移致使愈来愈多的神经细胞死亡。目前临床上除手术外常用药物有匹鲁卡品和噻吗洛尔。前者使处在虹膜周围部分的前房隙扩张以疏导房水来降低眼压，后者通过减少房水的生成来降低眼压。但两者都不能在眼压升高时对视网膜造成的缺血损伤起任何保护或治疗作用。当然患者的视功能亦因已造成的视网膜细胞的死亡而受到损害，眼压降低只能免遭新的损害。本专利技术旨在寻找一种药物，该药能在眼压升高时有效地保护视网膜免遭缺血引起的损害，达到在青光眼的临床治疗中保护患者视功能的目的。四环素类药物是由链霉菌产生或者经半合成制取的一类广谱抗生素。前者有四环素、土霉素、金霉素等，后者有美他环素、多西环素(强力霉素)和米诺环素等。抗菌作用的强弱依次为米诺环素、强力霉素、美他环素、金霉素、四环素和土霉素。由于四环素类药物的广泛应用，而且相互间存在着密切的交叉耐药性，所以其应用范围受到了限制，当前主要应用于立克次体、衣原体、支原体及回归热螺旋体等非细菌性感染和布氏杆菌病以及敏感菌所致的呼吸道、胆道、尿路及皮肤软组织等部位的感染。(《新编药物学》、陈新谦、金有豫主编、人民卫生出版社1997年7月第14版、P.74)。近年来国内外学者的许多研究发现四环素类药物尤其是强力霉素除了抗菌作用和穿透血脑屏障的能力外，还有其他生物学的作用。这些作用包括抑制基质金属蛋白酶、肿瘤引起的血管生成、恶性细胞生长以及骨吸收作用抑制多形核嗜中性粒细胞释放自由基；抑制可诱导型一氧化氮合酶以及过氧化氮对蛋白酪氨酸的硝化作用。实验及临床研究均表明强力霉素治疗关节炎有效以及治疗因中风引起的脑缺血(《美国科学院院报》1996年、93卷14014～14019)。四环素类药物还可以使脑缺血动物海马神经元NADPH-d阳性细胞数目减少，CAl区锥体神经死亡数目减少(《美国科学院院报》1998、95卷15769～15774)。近代分子生物学的研究表明，一氧化氮(NO)在缺血损伤中具有重要的病理意义。内源性NO是一氧化氮合酶(NOS)催化底物L-精氨酸分解而成。NOS包括神经元型nNOS、内皮型eNOS和可诱导型iNOS三种同工酶。其中nNOS和iNOS源性NO分别介导了缺血早期和后期的神经毒性的产生，对nNOS而言，其抑制剂在临床上的应用受到时间上的限制；对iNOS而言，其选择性抑制剂极具潜在的临床意义，因为当iNOS为眼压升高诱导时即具有强大的不依赖Ca++的催化活性，可持续产生NO。本专利技术选择四环素类药物中代表品种四环素和强力霉素对视网膜在眼压升高所造成的缺血损伤进行了研究，其技术方案是用人工方法使大鼠眼压升高造成缺血并维持1小时，在不同时间内腹腔注射施药，然后用组织化学技术观察结果并分析其保护作用。所述的组织化学技术即是尼氏(Nissl)染色技术和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-黄递酶(NADPH-d)染色技术，前者可观察到视网膜形态的变化，后者可观察到NOS阳性表达的神经元形态的变化。本专利技术的研究表明，当眼压升高至120mmHg柱并维持1小时，无论是缺血前还是缺血后给药，四环素和强力霉素均可以使视网膜节细胞层神经元存活率由空白对照组的45.5％分别提高到61.8％和80.0％；使缺血诱导的NADPH-d阳性细胞密度分别下降26.0％和30.0％。这就是说四环素类抗生素作为治疗青光眼的药物将显示其潜在的临床意义，因为它可以缓解视网膜节细胞层神经元的死亡，保护视网膜细胞免受眼压升高导致的缺血损伤，从而实现挽救青光眼患者部分视觉功能的目的。这一结果同时亦验证了理论所揭示的内源性NO在缺血损伤中的病理作用对视网膜的普遍意义。附图说明图1是尼氏染色分析视网膜组织形态变化的光学显微照片，石蜡切片，厚6μm。图中A)对照组(正常)B)缺血，生理盐水处理组C)缺血，强力毒素前处理组D)缺血，四环素前处理组E)缺血，强力毒素后处理组F)缺血，四环素后处理组GCL节细胞层IPL内网状层INL内核层OPL外网状层ONL外核层Scale50μm 。图2是节细胞层单位长度(0.5mm)上视网膜节细胞层神经元个数比较图，图中阴影部分为正常对照组的神经元个数，无阴影部分为缺血1小时第7天的神经元个数。图3是NADPH-d染色分析缺血及正常视网膜中NOS阳性细胞密度比较图。图4是尼氏染色分析缺血及正常视图网膜其横切片上单位长度视网膜节细胞层神经元个数比较图。图3、图4中自左至右依次为空白组(缺血未给药)、正常组(未缺血)、缺血前12小时给强力霉素和四环素、缺血后半小时给强力霉素和四环素。*表示P＜0.01，与缺血组比较。实验实施例动物及手术实验采用的是成年Wistar大鼠，体重在110-200克之间，雌雄不限。采用眼压升高模型造成视网膜缺血。动物用水合氯醛(0.42mg/g体重)麻醉后固定于立体定位仪上。双眼用阿托品(Atropin)扩瞳。待瞳孔放大后，将与生理盐水瓶相连的4号针头插入大鼠一眼前房，升高生理盐水瓶使液面至眼球上方1.6米(约120mmHg柱)使眼压升高，造成缺血并维持1小时，可观察到虹膜及眼底变白。作为对照，另一眼前房只插入与生理盐水瓶相连的针头，不升高盐水瓶，维持正常眼压。缺血1小时后降低实验眼一侧盐水瓶，取下针头。待动物清醒后正常饲养。整个手术过程注意保持大鼠的体温。药物治疗实验组给予溶于生理盐水、浓度为2％的强力霉素(购自西格玛SIGMA公司)或四环素(购自西格玛SIGMA公司)，对照组则注射生理盐水。给药途径均采用腹腔注射的方式。根据注射药物的不同，将实验动物分为12个试验组。具体见表1。药物用量1、第1、2、5、6、9、10组从缺血前12小时开始给药，剂量为45mg/Kg，每12小时一次。缺血后第一天剂量增加至90mg/Kg，缺血后36小时起减至45mg/Kg。2、第3、4、7、8、11、12组在缺血后30分钟开始给药，剂量为90mg/Kg，每12小时一次。缺血后36小时起每12小时注射45mg/Kg。表1.实验分组以及各组注射药物与首次注射时间 固定与取材缺血后第7天，将动物固定取材。水合氯醛深度麻醉动物。4％多聚甲醛灌流固定。摘取双眼，浸泡于4％多聚甲醛中后固定。一部分标本用于全视网膜铺片(NADPH-d染色)；一部分标本脱水透明后做石蜡包埋(Nissl染色)。组织化学用于NADPH-d染色的标本后固定约4小时。视网膜用0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)漂洗后入如下孵育液中1-2小时(37℃)1mmol/LNADPH，0.5mmol/L氮蓝四唑(NBT)，0.2％Triton X-100，0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。反应中随时检查反应产物直至显示完整细胞形态后，用0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)漂洗几次，再用蒸馏水漂洗。最后将视网膜整铺片于载玻片上，甘油封片。用于Nissl染色的标本后固定过夜。去掉角膜及晶状体的眼球用0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)漂洗后，依次经酒精梯度脱水，氯仿透明过夜。透明好的标本在60℃石蜡中浸泡、包本文档来自技高网...

【技术保护点】
四环素类抗生素在制备抗视网膜缺血损伤药物中的应用，其特征在于：四环素类抗生素在制备抗视网膜因眼压升高导致的缺血损伤药物中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兵，丁锦东，冯志华，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]