一种生物技术领域的猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1.0×103-1.0×1011拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。提取临床粪便样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR，根据其结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。所述的引物序列为序列1和序列2。本发明专利技术的优点无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，检测只需在2小时内即可完成，并且适用任何一款荧光定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物
的检测方法和基因引物，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis Virus, TGEV)引起的以病猪出现呕吐、水样下痢、脱水为特征的一种高度接触性传染病，对1周龄以下仔猪具有高度致死率。康复后仔猪发育不良，生长迟缓。该病能使康复成年猪的抗病能力与免疫功能受损，掉膘、降低饲料利用率， 浪费药物和人力等，造成严重经济损失。因此建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。TGEV编码四种结构蛋白，分别为纤突⑶蛋白、小膜(sM)蛋白、膜内蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白，其中只有纤突S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护的结构蛋白。此外，S蛋白含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，在宿主细胞亲嗜性、病毒致病性中起着关键作用。TGEV只有一种血清型，S基因高度保守，可作为靶基因进行TGEV病毒的诊断与检测研究，而目前尚未建立基于S基因的荧光定量染料法。经对现有技术文献的检索发现①目前TGEV荧光定量方法主要针对N基因，白兴华等根据TGEV的0RF6基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针，建立了 TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法 (白兴华，原志伟，李军民，王亚文，贺同欣，冯力，TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究.检验检疫学刊，2009，(5) :17-20)。但在该方法中未涉及S基因和染料法。②Ramesh等针对TGEV S基因设计的Taqman探针可以快速检测猪粪中的TGEV 含量(Vemulapallia R, Gulanib J, Santricha C, A real-time TaqMan RT-PCR assay with an internal amplification control for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus in swine fecal samples. Journal of Virological Methods, 2009,162 :231-235)。但该方法未涉及染料法。与探针法相比染料法优点在于无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，并且适用任何一款定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，公开一种猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。本专利技术根据实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒毒株的 S基因序列设计引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，具有较好的特异性和重复3性，其敏感性比常规PCR高100倍，可以用于TGEV的快速检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及的猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法，包括步骤如下(1)设计、合成引物根据TGEV S基因的序列，设计一对特异性引物。(2) PCR扩增S基因，获得目的片段，PCR产物割胶回收。C3)构建重组质粒，将目的片段与pMDIS-T载体连接，转化到DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR和测序鉴定。(4)荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量PCR反应体系和反应条件。(5)建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定OD^Onm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/ μ L，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，以5个稀释度的质粒标准品建立标准曲线。同时对猪粪便样本进行处理，处理后提取基因组RNA作荧光定量PCR，根据结果计算原始样品中TGEV的含量。所述的染料，是指SYBR Premix Ex Taq 11 (Perfect Real Time)(大连宝生物工程有限公司生产)。所述的荧光定量PCR反应体系如下总体积25 μ L :2X0ne Step SYBR RT-PCR Buffer 配制的母液 12. 5 μ L, DNA 模板 2 μ L，上下游引物(10 μ Μ)各0.5 μ L，DEPC处理过的水9.5 μ L。所述的荧光定量PCR反应条件如下95°C 预变性 3min，然后 95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s，；35 个循环，72°C 延伸 IOmin 所述的样品，加2倍体积的PBS，冻融3次。取上清液，按照IHrol Reagent试剂盒使用说明操作提取RNA进行检测。本专利技术还涉及如上述猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法中的引物，所述的引物，是指一对特异性引物，该对特异性引物序列如序列1和序列2。根据本实验室保存的TGEV毒株的S基因序列，设计特异性引物，扩增目的片段大小为Illbp0 PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMDIS-T载体并转化到 DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1. OX IO3-L OX IO11拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。本专利技术检测样本DNA浓度在1. OX IO6-L OX 101°拷贝/mL之间，Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R2 = 0.999。以不同病毒(猪瘟病毒疫苗株、 猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗株均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；Torque teno virus米用文献Zhu CX, ShanTL, Cui L, Luo XN, Liu ZJ, Tang SD, Liu Zff, Yuan CL, Lan DL, Zhao W, Hua XG. Molecular detection and sequence analysis of feline Torque teno virus (TTV) in China. Virus Res. 2010Dec 24. )的 DNA 作为模板， 同时设阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR检测。结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线，表明该方法特异性强。在同一反应体系进行批间重复，每个样品3个重复，Ct值变异系数分别为0. 973%,0. 489%,0. 829%,0.拟8%，均小于5%。表明误差都非常小，扩增效率稳定。在本专利技术中的术语“STOR Green I ”、荧光阈值、CT值和荧光定量PCR，在“检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒(CN101935696A) ”公开文献上均有记载。本专利技术使用染料法荧光定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，稀释，然后作出标准曲线图，未知的样本按标准曲线换算出对应的拷贝数。本专利技术优点在于无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，并且适用任何一款定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。本专利技术采用STOR Green I荧光染料荧光定量PCR，相比普通PCR检测方法特异性高，假阳性低，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪传染性胃肠炎病毒Ｓ基因荧光定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于，包括步骤如下：（１）设计、合成引物：根据ＴＧＥＶ Ｓ基因的序列，设计一对特异性引物，ＴＧＥＶ－Ｐ１和ＴＧＥＶ－Ｐ２；（２）ＰＣＲ扩增Ｓ基因，获得目的片段，ＰＣＲ产物割胶回收；（３）构建重组质粒，将目的片段与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化到ＤＨ５α感受态细胞，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ和测序鉴定；（４）荧光定量ＰＣＲ反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量ＰＣＲ反应体系和反应条件；（５）建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定ＯＤ２６０ｎｍ值，并将质粒浓度换算成拷贝数／μＬ，质粒标准品１０倍梯度稀释作为模板，以５个稀释度的质粒标准品建立标准曲线，同时对猪粪便样本进行处理，处理后提取基因组ＲＮＡ作荧光定量ＰＣＲ，根据结果计算原始样品中ＴＧＥＶ的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨志彪，顾江萍，袁聪俐，崔立，华修国，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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