猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物技术

一种生物技术领域的猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，标准品系列以10倍梯度稀释为终浓度在1.0×103-1.0×1011拷贝/mL，以其作为模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。提取临床粪便样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR，根据其结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。所述的引物序列为序列1和序列2。本发明专利技术的优点无需另外设计荧光探针，降低成本，操作简便，检测只需在2小时内即可完成，并且适用任何一款荧光定量PCR仪，可应用于规模大、通量高的样本检测中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的检测方法和基因引物，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis Virus, TGEV)引起的以病猪出现呕吐、水样下痢、脱水为特征的一种高度接触性传染病，对1周龄以下仔猪具有高度致死率。康复后仔猪发育不良，生长迟缓。该病能使康复成年猪的抗病能力与免疫功能受损，掉膘、降低饲料利用率， 浪费药物和人力等，造成严重经济损失。因此建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。TGEV编码四种结构蛋白，分别为纤突⑶蛋白、小膜(sM)蛋白、膜内蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白，其中只有纤突S蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护的结构蛋白。此外，S蛋白含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，在宿主细胞亲嗜性、病毒致病性中起着关键作用。TGEV只有一种血清型，S基因高度保守，可作为靶基因进行TGEV病毒的诊断与检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪传染性胃肠炎病毒Ｓ基因荧光定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于，包括步骤如下：（１）设计、合成引物：根据ＴＧＥＶ　Ｓ基因的序列，设计一对特异性引物，ＴＧＥＶ－Ｐ１和ＴＧＥＶ－Ｐ２；（２）ＰＣＲ扩增Ｓ基因，获得目的片段，ＰＣＲ产物割胶回收；（３）构建重组质粒，将目的片段与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化到ＤＨ５α感受态细胞，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ和测序鉴定；（４）荧光定量ＰＣＲ反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量ＰＣＲ反应体系和反应条件；（５）建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定ＯＤ２６０ｎｍ值，并将质粒浓度换算成拷贝数／μＬ，质粒标准品１０倍梯度稀释作为模板，以５...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志彪，顾江萍，袁聪俐，崔立，华修国，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31