本发明专利技术涉及一种检测猪Hokovirus的PCR检测方法，属于生物技术领域。具体采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管内分别加入缓冲液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，将试剂混合均匀后，至于PCR扩增仪中，进行变性、退火、延伸，共循环35次；PCR反应结束后，取10μl产物在琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外投射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，阳性样品可出现540bp片段。本发明专利技术所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用。
PCR method for detecting pig Hokovirus
The invention relates to a PCR detection method for detecting pig Hokovirus, which belongs to the technical field of biology. The reaction system of PCR 25 L, 0.2mlPCR in the reaction tube were added to the buffer, upstream and downstream primers, DNA polymerase and extract DNA template, add to the total volume of sterilizing ultrapure water, reagent mixing, as for PCR amplification, denaturation, annealing, extension, a total of 35 cycles PCR; after the reaction, take 10 mu l products in agarose gel electrophoresis, TAE buffer, PCR observation of the UV projection instrument, and compared with standard molecular weight, the positive samples can appear 540bp fragments. The detection method provided by the invention has the advantages of high sensitivity, good specificity, simple and rapid operation, low requirement for the quality of the detected material and convenient clinical application.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病毒学与动物传染病学
具体涉及一种对猪Hokovirus 进行检测的PCR方法。
技术介绍
猪Hokovirus (PHoV)是2008年在香港新发现的一种猪细小病毒(Lau等 Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J. Gen. Virol. 2008，89: 1840-1848)，其与牛Hokovirus 同属于 Hokovirus亚型，两者都属于细小病毒属(/^arraririaae)。猪Hokovirus与人4型和5型细小病毒(PARV4/5)的亲缘关系非常接近。猪细小病毒可引起猪的繁殖障碍病，以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。传染源主要来自感染细小病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒能通过胎盘垂直传播，感染母猪所产的死胎、 仔猪及子宫内的排泄物中均含有很高滴度的病毒，而带毒猪所产的活猪可能带毒排毒时间很长甚至终生。猪Hokovirus虽然属于细小病毒属，但目前尚无其致病的报道，不过Lau等学者研究发现，在健康猪群和患病猪群猪的淋巴结、血清、肝脏、鼻拭子和粪便中都能检测出该病毒的存在，且感染率非常高，可达44. 4%。从而，推测猪Hokovirus病毒可能会感染猪的大部分组织，而且由于在健康猪和患病猪中猪Hokovirus的感染率没有差异，所以该病毒是否会导致发病还需进一步的研究。同时研究者发现猪Hokovirus与猪繁殖与呼吸综合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)发生混合感染的现象十分普遍，混合感染率在64%左右。2010年，德国柏林的研究者Cornelia Adlhoch及其同事报道了猪Hokovirus在野猪中流行的石if究(Adlhoch 等 High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol. J. 2010, 7: 171)。该研究发现，在德国接受检测的野猪当中大约有三分之一携带猪Hokovirus病毒。另外，研究学者采用最新确立的定量实时PCR方法，在德国五个不同地区对野猪当中猪Hokovirus感染情况进行调查。在对收集的肝脏和血清样本进行分析之后发现，野猪中猪Hokovirus总体流行率非常高(32. 7%，51/156)。而且他们发现，该病毒的流行率因地区而异，随年龄增大而升高。在1年龄以内的野猪当中， 流行率为22%，但在成年野猪当中流行率上升为41%。对来自不同地区的三个分离株的两个接近全长的基因组和一个基因大片段进行了序列测定，并进行了遗传进化分析。结果表明， 德国野猪Hokovirus的基因序列与香港分离株表现出非常近的亲缘关系，其推测是由于动物产品的贸易往来导致该病毒从香港传入德国。到目前为止，人们对猪Hokovirus在除香港和德国以外的世界其它地方的存在与流行情况一无所知。而在2010年以来，我国大陆地区新发现了 3种新亚型的细小病毒， 分别为猪博卡病毒(porcine bocavirus)、猪细小病毒4型(PPV4)和猪Cnvirus (Huang等 Detection of a novel porcine parvovirus, PPV4, in Chinese swine herds. Virol. J. 2010,7: 333 ；Wang 等 Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus Genes. 2010,41: 305-308 ;Zhai 等 High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch. Virol. 2010, 155: 1313-1317)。因此，猪Hokovirus是否会和这些新的细小病毒一同在我国大陆出现成为研究的热点。 基于以上研究，申请人根据香港和德国研究者登录在GenBank中猪Hokovirus的基因序列(登录号GQ869539_GQ86卯43)设计并合成了一对检测猪Hokovirus的引物，建立了检测猪Hokovirus的PCR方法，并发现了该病毒确实存在于我国猪群当中。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低的检测猪Hokovirus 的PCR方法。技术方案参考GenBank登录的猪Hokovirus基因组序列(登录号GQ869539_GQ86卯43)，设计检测猪Hokovirus PCR方法的引物，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2 上游引物PHoVF: 5，- GTTGGTCCTGGTAATCCTTTGG-3，，在基因组中的位置为 2775-2796bp ；下游引物PHoVR: 5，- AGTCCTGGTATGAGAAGTGACG-3，，在基因组中的位置为 3293-3314bp。检测猪Hokovirus的PCR方法，包括以下步骤(1)猪HokovirusDNA的提取取472. 5 μ 1血清或100 mg的动物组织，加入1 ml PBS 缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472. 5 μ 1， 加入10% SDS 25 μ 1,20 mg/ml蛋白酶K 2. 5 μ 1，混合均勻后置于37°C消化过夜或50°C水浴4小时，加入等量酚氯仿异戊醇(25 M 1)抽提2次，取上清加2倍体积预冷的无水乙醇于-20°C 1小时，12000 rpm离心10分钟。弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μ 1超纯水溶解，即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于-70°C保存备用；(2)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；(3)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；(4)取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；结果判定有扩增产物约为MO bp条带，为阳性；无扩增产物约为MO bp为阴性。步骤(2)所述的PCR混合物包括采用25 μ 1的PCR反应体系，在0. 2 ml PCR反应管中分别加入 IOXPCR 缓冲液 2. 5 μ l,dNTP (2.5 mM) 1. O μ l，MgC12 (25 mM) 1. 5 μ 1， 上、下游引物各0.5 μ1,5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0. 5 41，0嫩模板1 μ ，用灭菌超纯水加至总体积，混勻。步骤(3)的扩增条件为94°C，5分钟，进行预变性；然后94°C，1分钟， 530C，1分钟，72°C，1分钟共循环35次；最后72°C延伸10分钟。本专利技术检测猪Hokovirus的PCR方法，阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．检测猪Ｈｏｋｏｖｉｒｕｓ的引物：其上、下游引物序列分别为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，何孔旺，毛立，温立斌，张雪寒，倪艳秀，郭容利，周俊明，茅爱华，王小敏，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84
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