本发明专利技术提供了用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。本发明专利技术还提供了含有上述引物和探针的试剂盒，以及使用上述引物和探针采用一步法RT-PCR检测兔出血症病毒的方法。本发明专利技术采用一步法RT-PCR检测技术，在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增，完全闭管扩增和检测，减少了多重操作污染的可能性，易于操作，减少加样过程中的体积损耗，保证结果的可信性，反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增，灵敏度更高。
Detection of rabbit hemorrhagic disease virus by fluorescent quantitative RT-PCR
The present invention provides primers and TaqMan probes for the detection of rabbit haemorrhagic disease virus by quantitative RT-PCR. The invention also provides a kit containing the primers and probes, and a method for detecting rabbit hemorrhagic disease virus by using the primers and probes and adopting one-step RT-PCR to detect the rabbit hemorrhagic disease virus. The invention adopts one-step RT-PCR detection technology, continuous quantitative reverse transcription and PCR amplification in a tube, completely closed tube amplification and detection, and reduce the possibility of multiple operation, pollution and easy operation, reduce the volume loss in the process of adding samples, credibility guarantee results, all cDNA samples are used for reverse transcription amplification, higher sensitivity.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种兔出血症病毒的分子检测方法，具体地说，涉及一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其属于生物
技术介绍
[ij IfiL^E (Rabbit hemorrhagic disease, RHD) ^ [ii(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一种高度接触烈性传染病，传播快，发病急，发病率和致死率都很高，以呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征， 是兔的一种毁灭性传染病，目前所有已测的兔的品种都表现出易感性。自然条件下，RHDV主要侵害成年兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病对养兔业造成巨大的经济损失，也严重威胁濒临灭绝的野兔品种。由此，RHDV引起了国内外学者高度重视，从形态学、 生物化学和分子生物学等各个方面系统的研究该病毒。RHDV在国际病毒分类委员会(ICTV) 2000年最新的第七次报告中被列入新成立的杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV为单股正链RNA病毒，其基因组由7437个核苷酸组成，分子量为2.4X 106-2.6X 106，5’端没有帽状结构，而是共价结合与感染相关的Vpg(virion protein, genome linked)蛋白，3’末端具有一个短的PolyA 尾。第l-9nt为5’非编码区，最后59nt为3’非编码区，含有两个开放阅读框架(ORF)，第 10-7044nt为ORFl编码的一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白经蛋白水解酶加工成主要衣壳蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在内的三个非结构蛋白。根据分析， 该病毒的RNA基因组结构与同科的猫嵌杯样病毒不一样，仅含有两个开放阅读框。RHDV的免疫原性蛋白、衣壳蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。VP60基因全长1740bp，在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用，其核苷酸极端保守。RHDV是一种急性、高度致死性RNA病毒，在兔体内停留时间短，没有足够的时间让病毒发生有利于进化的变异，因此几十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。目前，已有将分子生物学应用到RHDV诊断中的研究，其主要包括玻片凝集试验 (SHA)检测RHDV、酶联免疫吸附法(ELISA)检测RHDV、RT-PCR检测RHDV等，但上述这些方法存在敏感性低、可重复性差、结果判定易受多种因素影响、处理耗时多等问题。焚光定量 PCR (fluorescence quantitative polymerase chain reaction),又禾尔实时定量(real-time quantitative) PCR。这种技术是在PCR技术基础上发展起来的高度灵敏的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中引入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法，具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，扩大了 PCR的应用范围，使得PCR技术更广泛的应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学3研究等领域。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer (PE)公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20bp左右的寡核苷酸探针的5’端标记荧光报告基团(Itep0rter，R)，3’端标记荧光淬灭基团(QuenCher，Q)，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7-lOnm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5’ -3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。常用的荧光报告基团有 FAM、JOE、HEX、Texas-Red 等，淬灭基团有 TAMRA、Eclipse 等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan 探针。本专利技术的另一目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本专利技术的目的还在于提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示；本专利技术的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR 检测的TaqMan探针(荧光探针VP60p)，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 3所示，本专利技术所述的TaqMan探针，其5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光猝灭基团为 TAMRA0本专利技术根据GenBank (GenBank注册号FJ794180) RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物，并确认了各引物的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。本专利技术还提供含有如权利要求1所述的引物和TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。所述试剂盒还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNIPs。本专利技术还提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其采用一步法RT-PCR方法进行检测，包括如下步骤1)提取待测样品的RNA ；2)以步骤1)提取的RNA作为模板，用上述核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和TaqMan探针VP60p，采用一步法RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。其中，步骤1)中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物，所述样品还可以是用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。步骤2)中的RT-PCR反应体系为 每25 μ L反应液中含有2 X Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12. 5 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA 聚合酶 1 μ L、4U/μ L Quant 反转录酶 0. ；35 μ L、10 μ mol/L 的上下游引物各 0. 5 μ L、10 μ mol/L 的探针 0· 5 μ L、RNA模板 1 μ L,不含 RNA酶的水(RNase-free ddH20) 补足至25 μ L0RT-PCR 反应条件为50°C、30min，92°C、3min，92°C、10s，56°C、20s，68°C、20s，40个循环。为了便于分析检测结果，可在RT-PCR扩增步骤中使用阳性标准品和阴性对照，所述阴性对照是以DEPC处理的水代替RNA模板；所述阳性标准品按如下步骤得到1)提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No. 4和5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于兔出血症病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测的引物，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾广乐，苏国清，林祥梅，武昱孜，孙卫东，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11
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