载体经口服转导肝肠细胞制造技术

一种利用口服基因、载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂在肝、肠细胞中表达具有治疗作用量的生物活性蛋白或多肽的方法，其特征在于：该载体包括编码蛋白或多肽的核酸序列并可以在肝、肠细胞中促进蛋白或多肽表达的调控序列，经转染有该载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂的肝、肠细胞可以分泌蛋白或多肽进入循环系统或局部组织治疗糖尿病、癌症、肝硬化及其它代谢紊乱、遗传性、传染性疾病。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一种利用口服基因、载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂在肝、肠细胞中表达具有治疗作用量的生物活性蛋白或多肽的方法。本专利技术包括了对肝、肠道细胞体内转导方法和各个部分的改进，尤其体现在体内肝、肠道细胞表达治疗性蛋白和多肽治疗糖尿病、癌症、肝硬化及其它代谢紊乱、遗传性、传染性疾病。背景资料糖尿病基因治疗的首要目的是达到一个正常的血糖水平和避免反复注射胰岛素或由组织移植引起的免疫抑制。采用一种方便易得的载体直接在体内进行基因转移，可以避免组织移植所引起的器官来源和组织兼容性问题，是相对于胰岛移植治疗糖尿病的另一种有发展前景方法。目前已研究出多种基因治疗糖尿病方法，包括从把细胞存活基因直接转到胰岛细胞中到形成人造β细胞。然而总的来说，在以往进行的糖尿病基因治疗研究中不能通过生理机制调节胰岛素的释放，且一些回体的细胞移植方法在临床应用中存在不稳定性和潜在危险性。最近一项研究表明在糖尿病啮齿动物体内直接转导胰岛素类似物基因，获到了稳定的血糖水平，而这种稳定与对转基因进行了转录调节有关。重组腺相关病毒(rAAV)具有一些特性，使之成为进行最有应用可能的临床基因治疗载体之一。最近我们的研究表明口服腺相关病毒载体能使转基因在肠粘膜和固有层中得到持续表达(＞6个月)，可以使得乳糖不敏感的动物模型恢复正常性状并能持续很长时间。口服腺相关病毒载体治疗糖尿病可以避免现有糖尿病治疗方法中存有的某些问题，如组织移植中的组织来源有限，静脉注射、门静脉注射、实质器官(肝或肌肉)注射或是经基因改造后的细胞移植(其有不确定的生长特性)等侵入性治疗方法引起的副作用。胰岛素基因治疗的最主要障碍是难以将胰岛素的表达和释放能应对血糖浓度变化。最近研究表明通过门静脉注射能使基因得到足够的表达，使糖尿病动物模型血糖回复到正常水平。这些结果首次证明了胰岛素基因治疗潜在的治疗价值。尽管葡萄糖能诱导转基因的转录，但胰岛素类似物的释放却大大的延迟了。除非转录控制能够与浓缩在储存颗粒中成熟胰岛素的加工相关，使胰岛素能根据血糖水平释放，否则很难满足由于间断进食对胰岛素需求的快速变化而不能恢复血糖耐受或避免低血糖。一种可选的方法是使用胰岛素启动子，一种鼠的412bp胰岛素I启动子(RIP)片断很有价值，其保留了葡萄糖调节转录所必需的组件。我们假设口服腺相关病毒载体后，胰岛素基因在RIP调节下会在散在分布的神经内分泌细胞(DNES)中充分表达，获得构成性分泌和在缺少功能性的胰岛细胞时进行适当的调节性分泌。这种释放调节不仅仅是简单的依靠转录控制，还有赖于在DNES细胞中异位表达胰岛素。在DNES细胞表达的胰岛素的可以加工成熟并储存，其不但能释放内源性的肠肽，还能根据进食及时释放经过加工成熟了的胰岛素。摄取碳氢化合物后，DNES L细胞释放的类高血糖素样肽具有与胰岛素相似的动力学，因此这些细胞可在餐前和餐后释放适当的转基因胰岛素。此外成熟胰岛素将被释放到门静脉系统中，这也是胰岛素在机体中最主要的生理运送途径。然而在糖尿病鼠口服载体3天后，转导有载体的DNES细胞和肠道细胞释入的胰岛素急剧下降引起高血糖，这可能是由于这些被转导的细胞自然脱落造成的。因此本专利技术的目的是为了克服或至少是改进以往方法中一个或更多的缺点，或是能提供另一个有用的可选方法。
技术实现思路
本专利技术至少部分归功于此发现在口服包含目的核酸序列的载体前，延长禁食时间，能提高对肝细胞的转导效率。其直接结果是提高了目的基因在肝细胞中的表达和分泌。这种方法再配以适当剂量，配方和处理恰当的载体，将提供一种改进了的经口治疗需要在循环系统中维持足够的活性蛋白或多肽疾病的方案，如治疗糖尿病和糖代谢失调的胰岛素。实验开始时，STZ鼠(N＝6)服用2×1011rAAV/EF-human insulin(EF-hIns)颗粒，这种载体在构成性的延长因子1α(EF)启动子的控制下表达未经修饰的人胰岛素原cDNA(图1A)。EF-hIns载体经胃管进入STZ糖尿病鼠的胃部，这种糖尿病鼠的具有血糖高(水平大于20mmol/l)，循环中的C肽(图1C，小于20pmol/l)和胰岛素水平(图1.D，小于3.8UU/ML)低的特点。给药12小时内，STZ鼠的血糖水平从30mM降到3mM。急性低血糖可以通过腹膜下注射20％葡萄糖l～2ml和在最初48小时给予含10％葡萄糖的饮水得到纠正。其它对照鼠服用相同数量的表达β-半乳糖酶(AAVlac，n＝6)或荧光素酶(AAVluc，n＝6)rAAV载体，以确定在鼠的肠靶细胞中转基因胰岛素原基因是否表达，在口服药物的第3，17，30和90天处死实验鼠(各4只)，我们使用胰岛素原的单克隆抗体来检测转基因的表达，发现表达主要存在于固有层(图1.I)，这种情况与先前用AAVlac处理动物得到相同的试验结果，且30天和90天的表达量高于早期，但是用AAVlac或AAVluc处理动物，通过免疫学方法没有检测到胰岛素。转导的DENS细胞能持续表达3个月(图1J，K)(通过激素原转换酶鉴定)，而只有大约5％的细胞被转导，胰岛素原使用灵敏度和特异性好的ELISA(12-14pmol/L，Mercodia AB，Sweden)能够检测到，但成熟胰岛素水平在IMX系统(Abbott Lab，Tokyo)的检测范围以下(＜0.5μU/ml)。在为期90天的研究中，使用EF-hIns治疗的鼠血糖水平与原本的高血糖相比只能呈现一个暂时的下降，血糖在2周内达到并在余下的时间中保持在原来的高水平。这说明口服使用构成性启动子控制未经修饰的胰岛素原基因表达的载体不能将胰岛素原转变为成熟胰岛素。因为服用高剂量的含有构成性启动子的载体，在动物模型中出现严重的急性低血糖反应，所以没有使用。本专利技术的一个较好的体现是构建了一个融合胰岛素基因，由furin共有序列和B链被修改的人胰岛素原cDNA构成的，它能使潜在的靶细胞更有效的加工胰岛素原和分泌成熟的胰岛素。将此cDNA插入到一个表达框中，这个表达框两侧有145个碱基的AAV末端重复序列，含有一个412个碱基的鼠胰岛素启动子和一个转录后调节组件的3个组件，能更好的转运mRNA和保持mRNA的稳定。此AAV顺式质粒用于产生重组AAV载体，并用同样的方法产生了表达荧光素和半乳糖苷酶的对照载体。口服高滴度(大约10el2/ml核酸颗粒)的重组腺相关病毒载体以治疗链脲霉素糖尿病鼠(血糖＞20mM，C肽检测不到)。用药5～7周后，所有服用AAVfurIns质粒的鼠中没有发现酮类物质，在服用2×1011剂量STZ鼠中有大约40％血糖达到正常水平并维持6个月。这些对治疗敏感的大鼠体内有更高浓度的胰岛素和胰岛素原。使用一种不和鼠胰岛素起交叉反应的IMX检测方法特异性检测转基因人胰岛素的表达。412碱基的鼠胰岛素启动子能对胰岛素的表达起某些转录控制作用，并有助于肠神经内分泌细胞表达胰岛素。在糖刺激下能异位释放多达2-3倍的胰岛素。尽管在口服6-18小时之间会出现一个短暂的血糖降低，但长期来说血糖不会明显波动形成低血糖和高血糖。出人意料的是口服载体后也能转导肝细胞。恢复对机体代谢的控制需要一段时间与肝转导有关，这提示肝转导对能否长期维持正常血糖很关键。本专利技术将被更详细的描述在以下的例子中，但并不局本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用口服基因、载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂在肝、肠细胞中表达具有治疗作用量的生物活性蛋白或多肽的方法，其特征在于该载体包括编码蛋白或多肽的核酸序列并可以在肝、肠细胞中促进蛋白或多肽表达的调控序列，经转染有该载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂的肝、肠细胞可以分泌蛋白或多肽进入循环系统或局部组织治疗糖尿病、癌症、肝硬化及其它代谢紊乱、遗传性、传染性疾病。2.一种利用口服载体或纳米颗粒包含治疗基因的治疗试剂在肝、肠细胞中表达具有治疗作用量的胰岛素的方法，其特征在于该载体包括编码胰岛素的核酸序列并连接于一可以在肝细胞中促进胰岛素表达的调控序列，转染有该载体的肝、肠细胞可以分泌胰岛素进入循环系统或局部组织。3.一种利用口服载体或纳米颗粒包含上述载体的治疗试剂在肝、肠细胞中促进表达具有治疗作用量的生物活性蛋白或多肽并可以在受试对象中获得所期待的表达量的方法，其特征在于该载体包括编码蛋白或多肽的核酸序列并连接于一可以在肝细胞中促进蛋白或多肽表达的调控序列，转染有该载体的肝、肠细胞可以分泌胰岛素进入循环系统或局部组织，受试对象在口服载体前需要有充足的禁食时间以排空胃或/和肠道内的全部或绝大部分内容物。4.一种利用口服载体或纳米颗粒包含治疗试剂在肝、肠细胞中表达具有治疗作用量的胰岛素并可以在受试对象获得所期待的表达量的方法，其特征在于该载体包括编码胰岛素的核酸序列并连接于一可以在肝细胞中促进胰岛素表达的调控序列，转染有该载体的肝细胞可以分泌其表达的胰岛素进入循环系统或局部组织，受试对象在口服载体前需要有充足的时间以排空胃或/和肠道内的全部或绝大部分内容物。5.一种在受试对象口服包含核酸序列的载体或纳米颗粒后可以在体内肝细胞中表达外源基因的方法，上述的方法包括在口服上述载体前需要有充足的时间以排空胃或/及肠道内的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，马旭，
申请(专利权)人：许瑞安，马旭，
类型：发明
国别省市：