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新型钩端螺旋体疫苗制造技术

技术编号:605421 阅读:245 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
新型钩端螺旋体疫苗,是以钩端螺旋体外膜蛋白Lslp制备的基因工程蛋白疫苗,能有效的预防钩端螺旋体的感染,可用于预防钩端螺旋体病。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域。具体地说,本专利技术涉及钩端螺旋体膜蛋白Lslp(S-layer like protein)。本专利技术的Lslp蛋白是一种钩端螺旋体免疫保护性抗原,可用于制备钩端螺旋体疫苗。
技术介绍
钩端螺旋体(以下简称钩体)是系统发育进化上结构和遗传特征都较特殊的一类微生物,它所导致的钩端螺旋体病是在全世界范围内广泛流行的人兽共患的自然疫源性疾病。中国近几十年曾有数次大规模的流行,病死率居全国传染病的前十位,给农业和畜牧业造成极大的损失。1995年,被列入法定传染病。钩体疫苗是控制钩体病的重要手段。目前,国内外应用范围最广的为灭活全钩体疫苗(Inactivated whole-cell vaccine,WCV),它具有一定的保护效果,但灭活全钩体疫苗存在着几个重大问题(1)缺乏对所有致病钩体属的不同血清型的交叉保护作用。(2)不能有效的阻止动物肾脏带菌或尿液排菌,因此不能阻断钩体传播。(3)免疫持续时间短,一般一年左右,需每年或每两年重复接种。(4)接种后常见局部反应和全身发热等副作用。(5)运输保存不便。(6)制备疫苗须大量培养钩体,生产周期长,成本较高。近年研究表明,钩体外膜具有抗原活性,是抗体和补体的主要作用对象,以基因工程技术开发新的利用钩体外膜蛋白作为抗原的广谱、高效和安全的疫苗是研究钩体疫苗的热点。它具有许多优点(1)诱导机体产生全面的免疫应答,其保护性应答对不同型别的钩体具有交叉保护作用。(2)免疫保护持续时间长。(3)没有灭活疫苗可能引起的致病作用,具有高度的安全性。(4)生产简便,成本低,贮运方便,便于推广应用。专利技术内容本专利技术,通过基因工程手段。将钩端螺旋体外膜蛋白Lslp编码多核苷酸装载在合适的载体中,将要其转化或转导入宿主细胞,如转入大肠杆菌、卡介苗(BCG)或真核表达质粒中,在体外表达、纯化,再以纯化的蛋白或配以佐剂制成蛋白疫苗。该专利技术的蛋白疫苗能有效的预防钩端螺旋体的感染,可用于钩体病的预防。具体实施例方式1)以赖型钩端螺旋体基因组序列为模板,设计Lslp基因引物,克隆Lslp基因。2)通过基因工程手段,将克隆的Lslp基因转入合适载体,并将其转化或转入宿主细胞,如大肠杆菌、真核哺乳动物细胞和卡介苗等。3)在体外表达Lslp蛋白,可通过RT-PCR、凝胶电泳和Westernblotting等分子生物学手段进行鉴定分析。4)采用标准蛋白分离纯化技术,纯化表达蛋白。如离心、离子交换层析、疏水层析、亲各层析、高效液相色谱等。5)纯化的蛋白,经过加工处理,如侧链的修改、亲水性、亲脂性的改变,以及佐剂的添加等,可制成口服剂、针剂等剂型的疫苗,用于预防接种。实施例实施例1钩端螺旋体Lslp蛋白疫苗的制备用常规的基因工程方法,从钩端螺旋体基因组中克隆出Lslp基因,将钩端螺旋体外膜蛋白Lslp基因插入融合表达载体pGEX-1λT(Invitrogen公司),融合表达的受体菌选用大肠杆菌BL21(DE3)。常规条件发酵后,提取重组菌体蛋白,然后进行SDS-PAGE电泳,分子量与预测值吻合。大肠杆菌表达的外膜蛋白Lslp是GST融合蛋白,通过亲和柱分离纯化,得到纯的钩端螺旋体外膜蛋白Lslp。经分离、浓缩,加入佐剂制备成蛋白亚单位疫苗实施例2纯化的Lslp蛋白免疫接种及特异抗体效价测定纯化的Lslp蛋白以生理盐水配成0.2mg/ml的液体,背部皮下接种新西兰大白兔,初次接种后每隔两周加强一次,共三次。最后接种两周后,经耳缘静脉取血,用ELISA法检测抗体效价,经三次免疫后抗体效价高达1∶5120。表明Lslp蛋白能诱导机体产生高滴度的特异抗体。钩的端螺旋体Lslp蛋白的氨基酸序列1-50 MELKLVLRSSKDASRKEFRIKTSVRRSYQELEGLIGEIKKELVGKNTVSF51-100 SFKSGDIDGVLVFLDGQFLGKTPLQRSDILPGNRKVKYYMDGFQSEEKKV101-150 LIQDGGSFEMILSKTPKDGLISVTSNPEGASVYLGSEFLGKTPITNVRVK150-200 TGYNRLRLSMEGHVDLLKGVEIKKDEETKLDLVLKQGNTITYYKNKQNVF201-250 LDHSYNDFSIYSLYGTLLFYVGYYYFNLKANDLYDRARSRVNLTGLYYAS251-300 LSAPQDQFIGLYFYEERIIRETNRDAGKYQKLAGNFGRHEGLTGGVMIYG301-350 MAAMLILAITFYWLGLDEETLDVGAVPKNLNNPYAIPGQFIEIDSFAKFN351-353 LKF本文档来自技高网...

【技术保护点】
新型钩端螺旋体疫苗,含有钩端螺旋体外膜蛋白Lslp,其特征在于,该疫苗所含Lslp蛋白来自赖型钩端螺旋体,其氨基酸序列为:1-50MELKLVLRSSKDASRKEFRIKTSVRRSYQELEGLIGEIKKELVGKNTVS F51-100SFKSGDIDGVLVFLDGQFLGKTPLQRSDILPGNRKVKYYMDGFQSEEKKV101-150LIQDGGSFEMILSKTPKDGLISVTSNPEGASVYLGSEFLGKTPI TNVRVK150-200TGYNRLRLSMEGHVDLLKGVEIKKDEETKLDLVLKQGNTITYYKNKQNVF201-250LDHSYNDFSIYSLYGTLLFYVGYYYFNLKANDLYDRAR SRVNLTGLYYAS251-300LSAPQDQFIGLYFYEERIIRETNRDAGKYQKLAGNFGRHEGLTGGVMIYG301-350MAAMLILAITFYWLGLDEETLDVGAVPKNLNN PYAIPGQFIEIDSFAKFN351-353LKF。...

【技术特征摘要】
1.新型钩端螺旋体疫苗,含有钩端螺旋体外膜蛋白Lslp,其特征在于,该疫苗所含Lslp蛋白来自赖型钩端螺旋体,其氨基酸序列为1-50 MELKLVLRSSKDASRKEFRIKTSVRRSYQELEGLIGEIKKELVGKNTVSF51-100 SFKSGDIDGVLVFLDGQFLGKTPLQRSDILPGNRKVKYYMDGFQSEEKKV101-150 LIQDGGSFEMILSKTPKDGLISVTSNPEGASVYLGSEFLGKTPITNVRVK150-200 TGYNRLRLSMEGHVDLLKGVEIKKDEETKL...

【专利技术属性】
技术研发人员:鲍朗朱庆平张会东
申请(专利权)人:四川大学
类型:发明
国别省市:90[中国|成都]

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