本发明专利技术涉及一种用于预防钩端螺旋体病的三价基因重组疫苗及其制备方法。目的是提供的疫苗及其制备方法能够有效预防不同血清群问号钩端螺旋体感染且制造成本较低。技术方案是：本发明专利技术提供的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，是从黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体基因组中克隆了ｌｉｐＬ３２／１、ｌｉｐＬ２１和ｏｍｐＬ１／２三个基因，通过基因工程技术制备的融合基因ｌｉｐＬ３２／１－ｌｉｐＬ２１－ｏｍｐＬ１／２具有序列５所示的核苷酸序列和氨基酸序列，ｌｉｐＬ３２／１与ｌｉｐＬ２１、ｌｉｐＬ２１与ｏｍｐＬ１／２基因之间用序列４所示的相同的两条柔性肽连接。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗及其制备方法，尤其是用于预防钩端螺旋体病的三价基因重 组疫苗及其制备方法。
技术介绍
由致病的问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)感染所引起的钩端螺旋体 病是全世界流行的自然疫源性人兽共患传染病，尤其好发于水稻种植地区，因而我国是钩 端螺旋体病流行的主要疫区之一。问号钩端螺旋体自然宿主动物众多，感染后无症状或症状轻微，通常不死亡，但可 从尿液中排出问号钩端螺旋体，直接污染水源或经土壤污染水源(疫水)。由于问号钩端螺 旋体在多种水系中能存活较长时间并可经疫水迅速传播，故钩端螺旋体病是洪涝、地震等 自然灾害时重点防疫的传染病之一。我国地域辽阔，自然灾害频繁，因而始终存在着钩端螺 旋体病暴发流行的危险。2005年，钩端螺旋体病被列为国家重点监测的13种重大传染病之 一，最近又被列入国家计划免疫项目之中。接种疫苗是预防和控制钩端螺旋体病最为经济和有效的措施。目前国际上有两种 钩端螺旋体疫苗产品多价全菌死疫苗和多价外膜疫苗，目前以前者应用为主。然而，上述 疫苗在预防钩端螺旋体病中存在的问题是①问号钩端螺旋体血清群众多，不同地区流行 的钩端螺旋体血清群可有差别，多价全菌死疫苗或多价外膜疫苗对疫苗中不包含的问号钩 端螺旋体血清群感染仅有微弱保护力甚至无保护力；②钩端螺旋体病病人主要是农民，由 于多价钩端螺旋体全菌死疫苗、多价钩端螺旋体外膜疫苗均含脂多糖内毒素，故副作用很 大，接种者数日内不能进行体力劳动，严重影响了免疫接种的积极性。因此，研制对不同血 清群钩端螺旋体有广泛交叉保护作用通用型疫苗，对于钩端螺旋体病预防和控制具有极为 重要的意义并有广阔的应用前景。基因工程疫苗以人工重组表达的蛋白分子为抗原，免疫成分明确，无明显的毒副 作用，因而是当今新型疫苗研制的主要方向。病毒的抗原构造十分简单，其基因工程疫苗的 免疫保护效果较好，如乙型肝炎病毒的重组表面抗原疫苗。但细菌的抗原构造复杂，单一抗 原的基因工程疫苗往往免疫保护效果不佳，这是目前尚无细菌单一抗原基因工程疫苗产品 的主要原因，采用多抗原是提高基因工程疫苗免疫保护效果的有效途径之一。属特异性抗原是所有钩端螺旋体血清群均含有的一类抗原。我们发现，外膜脂 蛋白LipL32和LipL21及穿膜蛋白OmpLl是我国15群15型钩端螺旋体参考标准株、钩 端螺旋体分离株均表达的外膜蛋白抗原，其中LipL21编码基因只有一个基因型，OmpLl和 LipL32编码基因分别有3个(ompLl/1、ompLl/2和ompLl/3)和2个基因型(lipL32/l禾口 lipL32/2)，但各基因型表达产物抗血清对我国15群15型问号钩端螺旋体参考标准株均 有不同程度的交叉凝集，表明OmpLl和LipL32也是属特异性表面蛋白抗原。黄疸出血群 是我国主要流行的问号钩端螺旋体血清群，70%钩端螺旋体病例均为感染问号钩端螺旋体黄疸出血群所致，其余30%钩端螺旋体病例为感染问号钩端螺旋体流感伤寒群、秋季群、波 摩那群、澳洲群、犬群、七日热群等所致。上述问号钩端螺旋体各血清群lipL32基因型均 为lipL32/l型，问号钩端螺旋体黄疸出血群、波摩那群、澳洲群、犬群、七日热群ompLl基因 型为ompLl/2型，流感伤寒群、秋季群为ompLl/Ι型。因此，我们采用黄疸出血群赖型赖株 LipL32/l、LipL21和OmpLlA作为问号钩端螺旋体通用性三价基因重组新疫苗的抗原
技术实现思路
本专利技术的目的是要填补现有问号钩端螺旋体多价全菌死疫苗和多价外膜疫苗的 缺陷，提供一种能有效预防不同血清群问号钩端螺旋体感染且制造成本较低的通用型三价 基因重组疫苗及其制备方法。本专利技术提供的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫 苗，是一种同时含三种不同的问号钩端螺旋体属特异性外膜抗原LipL32/l、LipL21和 0mpLl/2的基因重组疫苗；它从黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体基因组中克隆了 lipL32/l、lipL21和ompLl/2三个基因，通过基因工程技术制备了上述三个基因的融合基 因^？！^？/！-^？！^丨 ！^！^/^彳所述的融合基因lipLSZ/l-lipI^l-ompLl/^具有序列5所 示的核苷酸序列和氨基酸序列)，为了保证融合基因原核重组表达产物中三个蛋白抗原有 良好的空间构型，lipL32/l与lipL21、lipL21与ompLl/2基因之间用序列4所示的相同的 两条柔性肽序列(Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser)连 接，构建了 lipL32/l-lipL21-ompLl/2 融合基因原核表达载体 pET42alipU2/1_lipm_°_V2，转化入 大肠杆菌 E. coli BL21DE3 中，建立了重组原核表达系统 E. coliBL21DE3pET42a-lipL32/1-lipL21-°mpL1/2, 其表达产物 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2 分子中同时含有 rLipL32/l、rLipL21、r0mpLl/2 三 种重组蛋白抗原，从而能对不同血清群问号钩端螺旋体感染具有免疫预防效果，不需要分 别重组表达rLipL32/l、rLipL21和r0mpLl/2，降低了生产成本，同时使制备方法更为简便 可靠。本专利技术预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制 备方法及其效果鉴定步骤1)黄疸出血群赖型赖株问号钩端螺旋体lipL32/l、lipL21 和ompLl/2基因的克隆和测序及其原核表达系统构建；2)lipL32/l-lipL21-ompLl/2融 合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导目的重组蛋白抗原 rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况 和产量；4)利用lipL32/l-lipL21-ompLl/2融合基因3’端预先设置的His标签序列，其 表达产物rLipL32/l-LipL21-0mpLl/2可用Ni-NTA亲和层析柱一次性提纯，提纯的产物用 SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定纯度；5)提纯的rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^直 接与氢氧化铝混合制备成注射液；6)采用问号钩端螺旋体金地鼠感染模型、金地鼠血清特 异性抗体显微镜凝集效价检测等方法，测定和确定问号钩端螺旋体通用型三价基因重组疫 苗rLipL32-LipL21-0mpLl免疫保护作用及其特异性抗体产生情况。本专利技术的有益效果是1)本专利技术通过人工融合基因及其原核表达的三价融合重 组蛋白rLipLSZ/l-LipI^l-OmpLl/^提供一种能预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的皮 内注射多价抗原基因工程疫苗，并采用金地鼠感染模型、血清特异性抗体测定等方法，证实 该基因重组疫苗皮下注射免疫后可使83. 3% 91. 7%金地鼠能抵抗三种不同血清群问号钩端螺旋体致死性感染而存活，存活金地鼠血清中含有能与我国15群15型问号钩端螺旋 体参考标准株产生效价为1 50 1 400的显微镜交叉凝集本文档来自技高网...
【技术保护点】
预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，其特征在于所述融合基因ｌｉｐＬ３２／１－ｌｉｐＬ２１－ｏｍｐＬ１／２的核苷酸序列和氨基酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：５所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严杰，
申请(专利权)人：严杰，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。