一对扩增钩端螺旋菌属１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的引物以及实时ＰＣＲ定量检测钩端螺旋菌属的方法技术

一对扩增钩端螺旋菌属１６Ｓ？ｒＲＮＡ基因的引物以及实时ＰＣＲ定量检测钩端螺旋菌属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）的方法，所述的引物对包括：正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是５’－ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３，反向引物的序列是５’－ＧＴＴＧＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴ－３’。与传统方法相比，本方法具有时间短、通量大、工作量小、可靠性高的优点，从样品的处理到定量检测环境中钩端螺旋菌属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）的时间缩短至４小时，而且由于是一种起始检测法，检测结果更加准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一对扩增钩端螺旋菌属(L印tospirillum)16S rRNA基因的引物以及 实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法
技术介绍
生物冶金技术是利用微生物、空气和水等天然物质从矿石中直接提取有价金属， 而无需选矿及火法炼制的短流程清洁生产工艺，通过微生物氧化矿石产生硫酸高铁和硫酸 等浸出剂，浸出过程基本不消耗除矿石、水、空气以外的其它资源，没有二氧化硫排放，资源 消耗低，对环境友好。生物冶金新技术使浮选-火法冶炼工艺不能利用的低品位及偏远地 区铜资源得以大规模开发，并使过去长年堆存的表外矿即使含铜0. 1 %以下亦有经济利用 价值。生物冶金技术被认为是二十一世纪矿产资源加工的战略性技术。 生物冶金过程是一个化学过程，微生物的作用主要是氧化铁和还原态硫，以及提 供溶解反应发生的空间(胞外聚合层)，但是细菌的作用是不能忽视的。浸矿环境中的细 菌可以分为两种一种就是可以氧化铁或(和)硫的细菌，如At. ferrooxidans，氧化Fe 的速度是溶解氧氧化速度的5X 105 1 X 106倍，产生的Fe3+通过化学作用氧化硫化矿，氧 化硫产生的硫酸也可溶解一部分硫化矿；还有一种菌就是异养菌，它们通过代谢自养菌产 生的有机物获得能量，一方面可以消除有机物对自养菌的毒害作用，另一方面可以在低氧 压条件下异养生长，以Fe3+为电子受体，可以产生Fe2+供铁氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。 生物浸矿过程是一个复杂的过程，其中涉及多种因素(生物、化学、物理)的相互 作用，微生物群落会随着浸矿环境中温度、pH、溶解氧浓度、C02浓度、Fe37Fe2+、硫酸盐浓度 和金属离子浓度等的变化而变化，而微生物群落的变化就会影响到浸矿的效率。现有的浸 矿微生物检测的方法多是基于PCR扩增后，再对所扩增的PCR产物进行检测，这种终点法的 检测往往不能真实的反应浸矿环境中的微生物组成。在PCR基础上发展起来的real-time PCR技术，实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间 大大縮短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。
技术实现思路
本专利技术提供一对扩增钩端螺旋菌属(L印tospirillum)16S rRNA基因的引物以及 实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法，该方法实现了环境中微生物组成的起点检测，省 去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大縮短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低 至几个拷贝的分子。 为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案本专利技术提供的用于检测钩端螺旋菌 属(L印tospirill咖)的引物对包括正向引物(F) (5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反 向引物(R) (5'-GTTGCTGCGTCAGGGTTT-3')(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。 这种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其 特征在于它包括以下步骤 (1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR 扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光 度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物 定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线； (2)、在实时定量PCR仪中以上述引物扩增环境中钩端螺旋菌属的16S rDNA基因， 通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号 转换到起始反应的核酸分子拷贝数。 由于细菌在进化过程中基因存在一定的突变，因此在引物设计时在Genbank中选 取某种细菌及相似细菌的16S rDNA序列进行比对，挑取该种细菌不同于别的细菌的序列作 为设计引物的基础(用Promega 3)。 本专利技术提供的用于检测钩端螺旋菌属(L印tospirillum)的方法为以上面提 供的引物对在实时定量PCR仪中扩增环境中钩端螺旋菌属(L印tospiri 1 lum)的16S rDNA基因。通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用已建好的标准曲线将荧 光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数，从而达到定量检测环境样品中钩端螺旋菌属 (X印tospirillum)的数量。附图说明 图1为钩端螺旋菌属(L印tospirillum)的标准曲线 图2为3种样品的荧光变化曲线图具体实施方式 实施例1 挑取本实验室保存的与L印tospirillum sp.(该标准菌株L印tospirillumsp.可 从中国典型培氧物保藏中心购买(武汉))具有99X相似性的阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，采用A卯lied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因扩增仪。50 ii 1的反应体系组成为:5 Xbuffer 10 ii 1，25mM Mg2+ 3ii 1， 10mM dNTPliil，正向引物(F)O. 5iU，反向引物(R)O. 5iU，模板liil， GoTaq DNA聚合酶 0. 25iU，无菌去离子水33. 75iU，每个样品做3个重复。反应条件为95。C预变性2min，然 后为30个循环的95。C变性45s，54。C退火45s，72。C延伸lmin，最后72。C延伸10min。反应 结束后将所得PCR产物按照Promega的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System操作说 明进行切胶纯化。纯化后的PCR产物采用Optizen 2120紫外分光光度计(Mecasys Co.， Ltd.)在260nm测定产物的吸光度值。然后根据公式(浓度=0D260 X 50 y g/ml X稀释倍 数)将吸光度值转化成DNA浓度。再根据下面的公式将DNA产物的质量转化为拷贝数 ^_歸)趣口鹏数=赠糧 单个碱基的平均摩尔质量x模板长度 对于双链DNA，采用660g/摩尔/碱基。10—9g的400bp的PCR产物相当于2. 51X109 个拷贝。 纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，使得PCR产物的拷贝数为1C)7-101。以此 PCR产物为模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪进行扩增。 25iU的反应体系组成为12. 5iU的含有SYBRGreen I染色剂、AmpliTaq Gold DNA聚合 酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems，进口的一种试 剂)，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，无菌去离子水6. 5 yl，每个 样品做3个重复。反应条件为95t:预变性5min，然后为45个循环的95。C变性15s，6(TC 延伸lmin。反应结束后，将温度由65t:缓慢升至95t:进行溶解曲线分析，检测反应的特异 性。 反应结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内参的荧光染料会被 释放出来，荧光信号逐渐减弱。基于产物长度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对扩增钩端螺旋菌属１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的引物，其特征在于：所述的引物对包括：正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是５’－ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３，反向引物的序列是５’－ＧＴＴＧＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴ－３’。

【技术特征摘要】
一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物，其特征在于所述的引物对包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物的序列是5’-GTTGCTGCGTCAGGGTTT-3’。2. —种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其特征在于它包括以下步骤(1) 、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；(2) 、在实时定量PCR仪中以上述引物扩增环境中钩端螺旋菌属的16S rDNA基因，通过仪器...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴宇，陈勃伟，温建康，
申请(专利权)人：北京有色金属研究总院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]