甲基化的免疫刺激性寡核苷酸和利用这些寡核苷酸的方法技术

本发明专利技术发现，通过将核苷酸包裹在脂质颗粒中，可使甲基化核酸，尤其是甲基化寡核苷酸，更尤其是含有甲基化胞嘧啶ＣＰＧ二核苷酸基元的甲基化寡核苷酸在体内具有免疫刺激活性。本发明专利技术还发现，通常在体内不具备免疫刺激性的包裹甲基化核酸，能与其包裹的未甲基化对应物同样有效或者比其包裹的未甲基化对应物更有效。本发明专利技术还发现了利用本文所公开的组合物和方法，来使应答抗原刺激的树突细胞活化和／或扩增的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请涉及脂质-核酸配制剂和其用于体内刺激免疫应答的方法，尤其涉及核酸序列的脂质体配制剂，所述核酸序列含有至少一个甲基化胞嘧啶从而协同地增强它们的免疫刺激活性，其中甲基化胞嘧啶优选形成CpG基元的一部分。
技术介绍
胞嘧啶的甲基化是真核生物中唯一已知的DNA内源修饰，其通过将甲基或羟甲基基团酶促加成到胞嘧啶的C-4或C-5位来实现。Costello和Plass，2001，J.Med.Genet.38285。许多研究者认为细菌DNA可在体外和体内激发免疫应答的原因是由于低频率的甲基化胞嘧啶残基在细菌DNA中存在的结果，相反具有高频率甲基化胞嘧啶残基的脊椎动物DNA就不能刺激任何免疫应答。Messina等，1991，J.Immunol 1471759。利用外周血单核细胞实验(PBMC)测定体外寡核苷酸促有丝分裂活性的随后研究表明未甲基化DNA可促有丝分裂，而甲基化DNA则不能促有丝分裂。在检验的大量寡核苷酸序列中，那些含有CpG二核苷酸基元的寡核苷酸序列表现了显著地促有丝分裂性。Krieg等，1995，Nature 374546-9。同样地，只要CpG二核苷酸基元的胞嘧啶未甲基化，则包含该基元的寡核苷酸在体内也显示免疫刺激性。Parronchi P.等1999，J.Immunol 1635946-53；Kreig A.M，1999，Biochim Biophys Acta 1489107-16。相似地，美国专利6,194,388公开了，当将CpG基元的胞嘧啶甲基化而其它胞嘧啶未甲基化时，通过体外将胸苷掺入PBMC来测定，在T细胞耗竭的脾细胞中B细胞的促有丝分裂活性被破坏。接着，根据在超过300个寡核苷酸序列中由体外尿苷摄取测定筛选它们在T细胞耗竭的脾细胞中诱导B细胞活化的能力的结果，相关美国专利6,207,646公开了，与缺少CpG基元的寡核苷酸相比，具有未甲基化CpG二核苷酸基元的寡核苷酸能更有效的刺激促有丝分裂活性，而相同CpG寡核苷酸的甲基化对应物并不同样有效。这再次表明，最不会影响B细胞促有丝分裂活性的甲基化位点是CpG二核苷酸的胞嘧啶，其被甲基化时与其它胞嘧啶的甲基化相比，体外刺激降低。同一组申请美国专利6,239,116(甲基化序列降低了NK细胞裂解活性)，美国专利6,406,705(当与HBsAg联合时非CpG寡核苷酸缺乏佐剂效应)和美国专利6,429,199(CpG基元的甲基化导致与GM-CSF联合时丧失刺激效应)得到了相似的结论。因此，总体上，甲基化CpG寡核苷酸一般不能有效地刺激体外促有丝分裂效应或激发体内免疫刺激性效应，或者所述效应低于甲基化寡核苷酸。最近，Schetter等在国际申请号WO02/069369中提示根据测定一些白细胞表面标记(包括CD86，CD80，CD25和CD69)的产生的体外PBMC试验，一些甲基化CpG寡核苷酸类型可具有免疫刺激活性。然而，测定的核酸序列在寡核苷酸(含有1-4个CpG二核苷酸)4-9个位点被重度甲基化，在所有例子中，甲基化寡核苷酸比其未甲基化对应物保留的有效性更低。还研究了多种其它寡核苷酸结构，包括肌苷取代鸟苷，胞嘧啶与肌苷相邻，“d间隔臂”含糖以避免对邻近肌苷的碱基的取代，ZpG二核苷酸(其中Z由2-脱氧尿苷、5-氟2-脱氧尿苷取代)，和CpY二核苷酸(其中Y由2-氨基嘌呤、黄苷、N7-甲基-黄苷、水粉蕈素或d间隔臂取代)。不幸地是，未提供有效对照序列，如随机序列或相同长度序列的混合物，来证实该体外试验的预测值和/或申请人对体内可能出现的免疫刺激活性的结论的准确性。而且，未观察到对树突细胞(抗原呈递细胞的重要亚型)的免疫刺激活性。本领域仍需要提高免疫刺激活性的改进佐剂组合物。该组合物必须能刺激较宽范围的抗原呈递细胞，尤其包括树突细胞。且该组合物必须能独立地、以及与肿瘤、病原体或其它抗原组合地刺激有效的体内免疫应答。本领域还对扩大用作免疫刺激性佐剂的核酸序列基元的范围感兴趣。尤其需要能由含有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸序列，以及其它已在体外免疫刺激活性中证实有显著可变性的寡核苷酸结构激发持续免疫刺激活性的组合物和方法。专利技术概述本专利技术人已发现将甲基化核酸序列掺入本专利技术脂质-核酸(LNA)配制剂能解决上述现有技术问题，并提供协同效益。尤其是当根据本专利技术所述使用时，能显著提高甲基化核酸序列的免疫刺激活性，并持续地获得提高的体内免疫刺激，与现有技术中广泛大量报导的结果形成鲜明的对比。令人惊讶地是，本专利技术的脂质-甲基化核酸配制剂还显示了与其具有相应未甲基化序列的相同脂质-核酸配制剂一样好的，在多数情况下更好的治疗效力。此外，在更宽范围的抗原呈递细胞，尤其在树突细胞中获得了免疫刺激活性。而且，如本文中所述，与现有技术不同，利用只有单个甲基化CpG二核苷酸的包裹的(encapsulated)核酸能获得有效的免疫刺激。一方面，本专利技术提供了在动物中刺激免疫应答的脂质-甲基化核酸配制剂，其含有脂质成分和核酸成分，其中核酸成分含有至少一个甲基化核酸序列。在一些优选实施方式中，甲基化核酸序列含有连接到至少一个胞嘧啶的C-4(4-mC)或C-5(5-mC)位的甲基或羟甲基基团，其中所述甲基化胞嘧啶残基通常是所述序列中CpG二核苷酸基元的一部分。在另一些优选实施方式中，脂质成分完全包裹甲基化核酸而形成脂质颗粒，见本文进一步描述。在一些实施方式中，当以游离核酸形式对动物给药时，甲基化核酸序列在体内无免疫刺激活性。在另一些实施方式中，脂质-甲基化核酸配制剂与具有相同序列但缺乏一个或多个胞嘧啶残基的甲基化的相应脂质-核酸配制剂相比，在体内具有相等或更好的免疫刺激性。在一个实施方式中，核酸序列含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个优选实施方式中，核酸序列含有单一的CpG二核苷酸，其中所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的。在一个特殊的实施方式中，所述核酸序列含有序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(ODN1m)。在另一个实施方式中，所述核酸序列含有至少两个CpG二核苷酸，其中CpG二核苷酸中至少有一个胞嘧啶是甲基化的。在进一步的实施方式中，序列中CpG二核苷酸的每个胞嘧啶都是甲基化的。在另一个特殊的实施方式中，核酸序列含有序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGTT 3′(ODN2m)。在另一个实施方式中，核酸序列含有多个CpG二核苷酸，其中至少有一个所述CpG二核苷酸含有甲基化胞嘧啶。然而很明显，而且并不像现有技术所教导的，如本文所述利用具有单个CpG二核苷酸或多个CpG二核苷酸的核酸序列可获得有效的免疫刺激，其中所述单个CpG二核苷酸只具有一个甲基化胞嘧啶，所述多个CpG二核苷酸的一对胞嘧啶是甲基化的。在优选实施方式中，当动物体内给药时，脂质-甲基化核酸配制剂能活化和/或扩增(expand)树突细胞。一方面，携有CD11c和DEC205中至少一种标记的树突细胞在体内通过给药受试配制剂(优选联合给与抗原刺激)而扩增。另一方面，携有CD11c或DEC205标记的树突细胞通过给药受试配制剂(优选联合给与抗原刺激)被体内活化而表达CD86标记。在各种实施方式中，脂质-核酸配制剂进一步含有可药用载体、缓冲剂或稀释剂。在一些实施方式中，核酸含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在动物中刺激免疫应答的脂质－甲基化核酸配制剂，所述配制剂包括脂质成分和核酸成分，其中核酸成分含有甲基化核酸序列。

【技术特征摘要】
US 2003-4-4 60/460,646;US 2002-11-7 10/290,545;US 1.一种在动物中刺激免疫应答的脂质-甲基化核酸配制剂，所述配制剂包括脂质成分和核酸成分，其中核酸成分含有甲基化核酸序列。2.根据权利要求1所述的脂质-核酸配制剂，其中所述甲基化核酸序列含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。3.根据权利要求2所述的配制剂，其中所述甲基化胞嘧啶包含连接到碳-4位(4-mc)或碳-5位(5-mc)的甲基或羟甲基基团。4.一种含有脂质-核酸(LNA)配制剂的佐剂，其中所述LNA配制剂包含a)脂质成分，其包括至少一种阳离子脂质；和b)核酸成分，其含有至少一种甲基化寡核苷酸；其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞应答抗原刺激。5.根据权利要求4所述的佐剂，其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞的扩增，其特征为，表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。6.根据权利要求4所述的佐剂，其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞的活化，其特征为，表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。7.根据权利要求4所述的佐剂，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含具有甲基化胞嘧啶的单个CpG二核苷酸。8.根据权利要求7所述的佐剂，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(ODN1m)。9.根据权利要求4所述的佐剂，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含两个CpG二核苷酸，且所述CpG二核苷酸中至少一个的胞嘧啶是甲基化的。10.根据权利要求9所述的佐剂，其中所述的甲基化核酸序列是具有序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGTT 3′(ODN2m)的寡核苷酸。11.根据权利要求4所述的佐剂，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。12.根据权利要求4-11中任一项所述的佐剂，其中所述寡核苷酸含有修饰的磷酸骨架。13.根据权利要求12所述的佐剂，其中所述修饰的磷酸骨架是硫代磷酸酯。14.包含脂质-核酸(LNA)配制剂以及至少一种靶抗原的疫苗，其中所述至少一种靶抗原与所述LNA配制剂混合或结合，所述配制剂包含a)脂质成分，其包括至少一种阳离子脂质；和b)核酸成分，其含有至少一种甲基化寡核苷酸；其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞应答由所述配制剂向抗原-呈递细胞呈递的所述至少一种靶抗原。15.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞的扩增，其特征为，表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。16.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞的活化，其特征为，表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。17.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含具有甲基化胞嘧啶的单个CpG二核苷酸。18.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含多个CpG二核苷酸，且所述CpG二核苷酸中至少一个的胞嘧啶是甲基化的。19.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。20.根据权利要求14-19中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种靶抗原包含微生物抗原。21.根据权利要求14-19中任一项所述的疫苗，其中所述至少一种靶抗原包含肿瘤相关抗原。22.根据权利要求14所述的疫苗，其中所述至少一种靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：英K塔姆，肖恩森普尔，桑德拉克利穆克，加尼亚奇克，
申请(专利权)人：伊内克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]