本发明专利技术公开一种可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物，该龟板提取物为乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按１０ｍｇ／ｍｌ的比例溶解，并经０．４５μｍ的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝４７．５∶４７．５∶５为流动相，波长为２５４ｎｍ，色谱柱为Ｄｉｋｍａ Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８５ｕｍ ２５０×４．６ｍｍ，进样量为１０ｕＬ，流速为１．０００ｍｌ／ｍｉｎ的条件下进行高效液相ＨＰＬＣ检测，在保留时间依次为１．５９±０．０５ｍｉｎ、２．７２±０．０５ｍｉｎ、３．００±０．０６ｍｉｎ和４．８６±０．０５ｍｉｎ处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为１．４５％、６．１４％、５６．３１％和３１．４５％。本发明专利技术所述的龟板提取物是由龟板经粉碎，石油醚分析纯回流提取除杂，残渣再用乙酸乙酯分析纯回流提取得到的。本发明专利技术所述龟板提取物可制成各种常用的剂型，对促进骨髓间充质干细胞生长具有显著的技术效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种中药提取物及其制备方法，具体涉及龟板提取物(Plastrum Testudinis Extract，PTE)及其制备方法。
技术介绍
传统医学认为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)的主要功能是参与构成造血干细胞生存和分化的微环境，而近代医学研究发现，它具有向多种细胞系分化的潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和脂肪细胞等，进而得出MSC扩增数量少而慢是导致人类很多重大疾病(如神经损伤，神经退行性疾病，心脏损伤、骨质疏松、再障等)的主要原因。但是，人的骨髓中的MSC不仅含量极少，而且扩增速度慢，而进行在体或体外移植，存活率又较低。因此，提高骨髓中的MSC含量是困扰广大医务人员的技术难题。现代中医学研究表明，龟板咸、甘、平，入肾经，滋阴补肾之力强，所以在许多治疗与骨髓中MSC含量水平有关的疾病的传统组方中普遍使用龟板与其它原料药进行配伍。但这些传统药方普遍存在治疗周期长，效果不明显的缺陷，随着科学技术的发展，中医药领域引入了现代提取制备方法。目前，龟板的提取方法主要有氯仿-甲醇超声提取，乙醇提取和水提取。采用脂溶性化学成分分析方法对氯仿-甲醇超声提取物进行成分分析，结果表明氯仿-甲醇超声提取物含有胆甾醇、十二烯酸胆甾醇脂、甾醇-4-烯-3-酮和脂肪酸，且10-十八碳烯酸含量最高(参见孙苏亚，李发美，黄喉拟水龟板中三种甾类化合物的分离和鉴定，中国中药杂志，2000，25(3)165-166和孙苏亚，李发美，龟板中脂肪酸的GC-MS分析，药物分析杂志，1999，19(6)406-409)。将乙醇提取物和水提取物进行游离氨基酸和水解后进行化学成分分析，发现这两种提取物均含17种氨基酸及Zn、Fe等人体必需微量元素(方达任，张克兰，刘焱文，龟板、鳖甲炮制前后化学成分的变化，中国药学杂志，1989，24(1)26-28)。上述提取方法所得到的龟板提取物对去势造成的大鼠骨质疏松有一定的治疗，但是，氯仿和甲醇都是有毒性溶剂，易造成提取物残留有毒溶剂，对环境造成污染，龟板乙醇提取和水提取物对骨髓间充质干细胞生长无促进作用。因此，寻求一种绿色环保的提取方法，得到促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物则成为本领域内渴望解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种促骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物。本专利技术的另一目的是提供一种绿色环保的龟板提取物的制备方法。本专利技术的再一目的是提供一种含有龟板提取物的药物组合物。本专利技术所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物为一种乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并经0.45μm的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5为流动相，波长为254nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为10uL，流速为1.000ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测，在保留时间依次为1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为1.45％、6.14％、56.31％和31.45％(参见说明书附图1)。上述高效液相HPLC检测所用仪器为DIONEX summit P680(四泵，带自动进样)，所用检测器为PDA-100 Photodiode Arry Delector。本专利技术所述的龟板提取物，在常温(25℃)下为深咖啡色膏体，难溶解于水，易溶于有机溶剂，在乙醇中溶解量为20mg/ml，氯仿溶解量为50mg/ml，二甲亚砜中溶解量为33.3mg/ml。本专利技术所述的龟板提取物是从龟板中提取得到。其中所述龟板是指乌龟的腹甲和背甲，较好是腹甲。本专利技术技术方案中所述的常温为25℃。本专利技术所述的龟板提取物含有脂肪酸类27～35％、脂肪酸酯类52～60％、甾体2～10％。其中，所述的脂肪酸类含有十四碳羧酸、十六碳羧酸和十八碳羧酸；所述的脂肪酸酯含有十六碳羧酸甲酯、十六碳羧酸乙酯、十八碳羧酸甲酯、十八碳-9-烯羧酸甲酯和十八碳-9-烯羧酸乙酯；所述的甾体含有3-胆甾醇和3，5-二胆甾烯。本专利技术所述的龟板提取物制备方法是(1)将龟板粉碎成10～40目的细粉；(2)用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回流提取8～12小时，除去石油迷提取物；(3)将残渣用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在60～80℃下回流提取8～12小时，减压并加热浓缩去除乙酸乙酯得到龟板提取物。上技术方案步骤(1)的一个较佳具体制备方法是将龟板粉碎成20目的细粉。上技术方案步骤(2)的的一个较佳具体制备方法是用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在60℃下回流提取12小时，除去石油迷提取物。上技术方案步骤(3)的的一个较佳具体制备方法是用龟板粉质量的6～12倍的乙酸乙酯在70℃下回流提取12小时，减压并加热浓缩除去乙酸乙酯得到龟板提取物。本专利技术技术方案中所使用的乙酸乙酯为常用的分析纯，所使用的石油迷为常用的石油迷分析纯；所述的龟板粉与提取介质之间的比例为重量/体积比(本领域的习惯做法)，即龟板粉为重量单位，石油迷分析纯和乙酸乙酯分析纯为体积单位。本专利技术所述的含有上述龟板提取物的药物组合物，含有治疗有效量的龟板提取物和常用的辅剂或赋型剂。本专利技术所述的含有上述龟板提取物的药物组合物，其中龟板提取物的药用注射剂，是将上述龟板提取物先经硅胶柱层析，再用石油醚-乙酸乙酯混合液，按1％递减梯度洗脱2次，接着蒸发浓缩成无色蜡状固体，最后加20～40倍的1，2-丙二醇溶解得到。所述无色蜡状固体与1，2-丙二醇的为重量/体积比。本专利技术所述的含有龟板提取物的药物组合物除注射剂以外的其它剂型，本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的辅剂、赋型剂的使用形式和用量。本专利技术所述的含有龟板提取物的药物组合物除注射剂以外的其它剂型，采用本领域常用的制备方法。例如将上述龟板提取物和药物辅剂混合均匀即得。本专利技术所述的含有龟板提取物的药物组合物，其剂型还可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、混悬液中的任何一种。本领域技术人员可以依据本领域已知的方法得到所用的剂型。本专利技术所述的含有龟板提取物的药物组合物，其剂型最好是胶囊和针剂。本专利技术药物具有促进MSC生长的积极作用，应用于干细胞移植治疗重大疾病，如治疗神经损伤，神经退行性疾病，心脏损伤、骨质疏松、再障等。以下通过药理试验及其结果来说明本专利技术所述的龟板提取物在治上述疾病中的有益效果。为了描述方便而不会产生歧义，以下所述的龟板提取物未特别定义的均为本专利技术所述的龟板提取物(龟板的乙酸乙酯提取物)。(一)活性比较近代医学研究结果表明碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor，bFGF)是促细胞增殖作用强的细胞生长因子，因此本专利技术选用bFGF为阳性对照，与龟板提取物作用比较，结果表明龟板提取物比bFGF作用强。以上结果提示龟板提取物具有进一步研发新型促干细胞生长药物的潜力，并且可能获得比传统细胞因子更好的效果。1材料与方法1.1试剂和实验动物1.2MSC分离、扩增与鉴定1.3.1不同龟板提取物和bFGF作为比较标准对MSC的增殖活性影响传3代MSC分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物，该龟板提取物为乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按１０ｍｇ／ｍｌ的比例溶解，并经０．４５μｍ的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝４７．５∶４７．５∶５为流动相，波长为２５４ｎｍ，色谱柱为ＤｉｋｍａＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８５ｕｍ２５０×４．６ｍｍ，进样量为１０ｕＬ，流速为１．０００ｍｌ／ｍｉｎ的条件下进行高效液相ＨＰＬＣ检测，在保留时间依次为１．５９±０．０５ｍｉｎ、２．７２±０．０５ｍｉｎ、３．００±０．０６ｍｉｎ和 ４．８６±０．０５ｍｉｎ处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为１．４５％、６．１４％、５６．３１％和３１．４５％。
【技术特征摘要】
1.一种可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物，该龟板提取物为乙酸乙酯分析纯提取物，将其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并经0.45μm的滤膜过滤后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5为流动相，波长为254nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为10uL，流速为1.000ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测，在保留时间依次为1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为1.45％、6.14％、56.31％和31.45％。2.权利要求1所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物含有脂肪酸类27～35％、脂肪酸酯类52～60％、甾体2～10％。3.权利要求1或2所述的可促进骨髓间充质干细胞生长的龟板提取物的制备方法由下列步骤组成(1)将龟板粉碎成10～40目的细粉；(2)用龟板粉质量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈东风，杜少辉，李伊为，黎晖，周健洪，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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