阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。公开了在使用腺相关病毒作为基因传递载体时，联合使用一定剂量的阿糖胞苷，可以明显增加腺相关病毒对正常和肿瘤细胞的转导效率，使腺相关病毒介导的外源基因的表达时间明显提前、阳性率明显增加、表达水平明显提高，从而改善以腺相关病毒作为载体的基因治疗效果，特别是在眼底病、遗传病以及肿瘤等疾病基因治疗中的应用。在肿瘤基因治疗中具有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，和明显增加腺相关病毒介导的基因转导效率和表达水平的作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。技术背景腺相关病毒简称AAV，属于细小病毒科，是一种线性单链DNA病毒，外包二十面 体衣壳蛋白，直径20nm,是动物病毒中最小的一种。可分多种不同的血清型，其中 AAV2是基因治疗中最常用的--种。AAV病毒具有如下特性第--，AAV无明显致病性。 据报道，尽管人群中8W的个体呈现AAV血清阳性，但未见其与任何一种疾病有明显 相关性。第二， AAV是一种缺陷型病毒，不能独立复制。在无辅助病毒(如腺病毒、 疱疹病毒等)感染时，AAV呈潜伏状态。第三，位点特异性整合。MV是唯一一 种以位点特异性的方式整合在人类染色体上的真核病毒，现已明确整合位点为19号 染色体长臂。机理尚不清楚，可能与病毒的ITRs和r印蛋白有关。第四，宿主范围广。 AAV可感染多种类型的组织和细胞，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞(如神 经元、肌细胞、造血干细胞等)也较敏感。第五，用于基因治疗的AAV载体为重组AAV (称rAAV)，由于MV的基因组容量较小，约5kb，其中ITR是AAV包装必须的。基因 治疗用rAAV载体只保留了ITR，去除了腺相关病毒所有的编码基因，给外源基因约 4. 7kb的容量。故当重组的腺相关病毒感染细胞后仅有所携带的外源基因表达，不伴 随任何病毒基因表达，免疫原性很弱，几乎不引起免疫排斥反应。第六，能介导治 疗基因较长时间稳定表达。因此，被认为是遗传性疾病较好的基因传递载体。目前 国际上有38个方案使用rAAV作为载体。但是，单独使用rAAV时，其感染和转导效率不高，表现在rAAV感染后治疗基因 开始表达的时间较晚、表达水平较低，故治疗效果不够理想，故目前仍然是基因治 疗临床试验中应用较少的一种病毒载体。由于rAAV具有其他病毒载体不具备的优点，如果能够改善rAAV的感染和转导效率，将明显改善rAAV的治疗效果，并拓展rAAV的 应用范围。那么，如何才能改善rAAV的感染和转导效率呢？ AAV成功感染是以病毒附着在 细胞表面为第一步的多步骤的过程。随后病毒被细胞摄取，然后在胞内被运输，转 运到细胞核内，或潜伏在核内或在某些辅助因子的作用下在细胞核内复制产生新的 病毒基因组，类似大多数病毒感染宿主细胞的过程。以最常用的II型重组腺相关病 毒(rAAV2)为例，rAAV2首先与硫酸乙酰肝素(heparinsulfate proteoglycans, HSPG) 结合，由于所有粘附细胞表面都表达葡萄糖胺聚糖，这也为rAAV2广泛的趋向性或亲 嗜性提供了一个简单的解释。另外，还有两种受体已被发现与rAAV2感染有关，它们 是a v e5整合素和成纤维细胞生长因子l(FGFRl)。而针对a v e 5整合素的抗体不 能干扰病毒与细胞的结合但却抑制了细胞对病毒的内吞作用，故推测a v 0 5整合素 似乎是AAV2被细胞内吞所必需的，但具体的内吞过程和接下来的步骤目前仍然不太 清楚。Sanlioglu等证明细胞内氧化还原调控蛋白Racl的活性能增强AAV2的内吞,他 们的研究表明，经过毗咯垸二硫代碳酸盐(pyrrolidinedithiocarbonate, PDTC)和 具有遗传毒性的因素(UV或H202)协同处理后,细胞对于rAAV的内吞和吸收明显增加， 但每一种试剂单独处理细胞对rAAV的内吞作用无明显提升。rMV是一种单链DNA病毒(ssDNA病毒)，它所携带的基因要表达需要经过单 链转换成双链(duble-stranded DNA dsDNA)的过程。只有双链DNA才具有转录能力。 有研究结果表明，rAAV进入靶细胞后，游离的单链状态的rAAV基因组只能存在很短 时间，其中大部分被靶细胞的酶识为受损伤的DNA而被降解。在某些情况下，AAV脱 衣壳后其单链DNA可转变成双链DNA。单链DNA转变成双链DNA可能有以下二条途径。 一条是以单链AAV DNA为模版合成另--条链，有研究报告腺病毒的E40RF6基因、UV 照射以及基因毒性化学药品等可增强这个过程；另一条是来自两个AAV病毒颗粒、极 性相反的单链退火形成双链。由于AAV是单链DNA病毒，末端的ITR折叠形成发夹样的 结构，复制是从AAV基因组折叠的3'端以AAV基因组自身作为模版合成双链DNA。双 链DNA再解链，正、负链以同等的效率被包装成新的病毒颗粒。故感染细胞后正、负链可通过退火形成双链。rAAV在细胞内的这些特点导致了其转导的延迟和偶然发生 的无效转导。最近有研究表明细胞内一称为FKBP52的蛋白和热休克蛋白90 (HSP90) 可以改变AAV的转导效率。前者的磷酸化形式与病毒末端反向重复D-序列相互作用， 抑制病毒第二链的合成，限制转基因的表达。后者在AAV转导中表现为FKBP52-AAV D-序列复合物的一部分，但其本身不与D-序列结合。所以KBP52和HSP90均能通过改变 AAV的第二链合成从而达到改变AAV转导效率的作用。阿糖胞苷是一种抗肿瘤药物，又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，阿糖胞甙，阿糖胞嘧 啶(外文縮写为CAR， CA， Ara-C),为一类作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢 药物，化学名1-e-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮盐酸盐。分子式 C9H13N305 HC1。分子量279.68。阿糖胞苷不存在于自然界，与生理性类似物胞 核苷(Cytidine)的区别在于其2'糖分子的位置上有OH基。Ara-C在细胞内先经 脱氧胞苷酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷酸(Ara-CMP)，再转化为二磷酸 阿糖胞苷(Ara-CDP)及三磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)而起作用。后者与三磷酸脱氧 胞苷竞争，竞争性抑制DNA多聚酶，并插入到DNA链内，阻止DNA链的延长，并引 起链断裂，从而抑制DNA合成。前者能抑制核苷酸还原酵，阻止核苷酸转变为脱氧 核苷酸，抑制细胞DNA聚合及合成，但对RNA和蛋白质合成无显著作用，Ara-CTP 还可以改变细胞内磷脂和糖蛋白的代谢，而致细胞毒性作用。Ara为细胞周期特异 性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，对抑制RNA及蛋白质合成的作用较 弱。临床上主要用于治疗恶性肿瘤。但Ara在提高AAV介导的基因转导效率和表达 水平方面未曾被发现和报道。也没有人尝试在基因治疗时特别是对变性和遗传性疾 病基因治疗时使用Ara以提高AAV介导的转导效率、基因表达水平和持续时间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于基因治疗的复合制剂，具体涉及阿糖胞苷与 腺相关病毒的复合制剂及其用途。包括一定浓度的阿糖胞苷与腺相关病毒组成的复 合制剂，及复合制剂的基质；以及在眼病、遗传病及恶性肿瘤基因治疗时联合(同时或先后)使用阿糖胞苷与腺相关病毒，包括系统给予阿糖胞苷和腺相关病毒或系 统给予阿糖胞苷局部使用腺相关病毒或局部使用阿糖胞苷与腺相关病毒，以增强腺 相关病毒介导的基因的转导效率、表达水平和持续时间的方法和用途；以及阿糖胞 苷在提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表达水平与持续时间、改善腺相关病毒 载体基因治疗效果的新的药用用途。本专利技术实验证实阿糖胞苷与腺相关病毒组成的的复合制剂,或在给予腺相关病 毒时联合使用阿糖胞苷可显著提高腺相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质：（１）抗肿瘤药物阿糖胞苷；（２）腺相关病毒，包括ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５或其他血清型如ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７和／或ＡＡＶ８。

【技术特征摘要】
1、一种阿糖胞苷与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质(1)抗肿瘤药物阿糖胞苷；(2)腺相关病毒，包括AAV1、AAV2、AAV5或其他血清型如AAV3、AAV4、AAV6、AAV7和/或AAV8。2、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的腺相关病毒的用量为IX 109 1 X1013 AAV病毒颗粒。3、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的阿糖胞苷的用量为0.001~ 10ug。4、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的复合制剂中的基质是注射 用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基。5、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征所述的制剂是冻干形式或液体形式。6、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是其给药方式采用局部注射或静脉 注射方式。7、 根据权利要求6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式是阿糖胞苷与腺 相关病毒混合后以混合物形式给药，或分别给予阿糖胞苷与腺相关病毒包括在 局部分别注射阿糖胞苷与腺相关病毒，或同时静脉注射阿糖胞苷与腺相关病毒； 或局部注射腺相关病毒或静脉注射阿糖胞苷。8、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式其中给药的 时间顺序是提前注射阿糖胞苷然后再注射腺相关病毒，或同时注射阿糖胞苷与腺 相关病毒，或先注射腺相关病毒后再注射阿糖胞苷。9、 权利要求1所述的复合制剂在制备提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表 达水平与持续时间和/或改善腺相关病毒载体基因治疗效果药物中的用途。10、 按权利要求1的用途，其特征是所述的用途是制备眼病基因治疗、遗传病基 因治疗、恶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄倩，张圣海，吴继红，吴小兵，董小岩，李川源，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]