阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及新的基因治疗复合制剂及其用途和使用方法。公开了在使用腺相关病毒作为基因传递载体时，联合使用一定剂量的阿霉素，可使腺相关病毒开始表达外源基因的时间明显提前，转导效率和基因表达水平明显增加，表达时间也明显延长，实验结果表明，复合制剂对细胞未见明显的毒、副作用。本发明专利技术复合制剂和使用方法可用于指导和辅助眼病、遗传性疾病和肿瘤等的基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种新的基因治疗复合制剂，具体涉及阿霉素类抗肿瘤 药物与腺相关病毒的复合制剂及其用途和使用方法。
技术介绍
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)，属于微小病毒科(parvoviridae),目前已 发现的AAV至少有8种血清型，AAV1-AAV8。它们的主要区别在衣壳蛋白，并因此导致各 种不同血清型AAV对不同的组织和细胞感染效率不同。目前基因治疗领域普遍采用的AAV 为血清型2，即AAV2。由基因工程改造产生的重组腺相关病毒称rAAV， rAAV作为基因传 递载体的优越性主要有①AAV对人体无致病性，十分安全，约80%的成年人的血清中可 以检测到AAV壳蛋白的抗体，但不表现出疾病；②免疫原性低，可以反复多次使用；③宿 主范围广，并能感染分裂细胞和非分裂细胞； 野生型AAV可定点整合至人的19号染色 体，并能较稳定的存在，既避免了其他病毒因随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因 激活的危险，又为外源基因的表达提供了较固定的染色体环境。重组后的rAAV特异性的基 因组整合虽不明显，但可以环状或串联状核外附加体的形式长期存在，介导外源基因持续稳 定表达；⑤AAV具有较好的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于纯化和 储存。因此，作为一种基因导入系统，AAV载体在遗传性疾病基因治疗中的应用日见增多， 据不完全统计，截止2006年1月，在全世界范围内开展的基因治疗临床试验中38项(3.3%) 采用重组腺相关病毒作载体(简称rAAV)，主要应用于遗传病。目前在眼底病如遗传性视 网膜变性等疾病的基因治疗实验研究中也不乏使用rAAV的。但是，AAV载体也存在某些局限性①AAV病毒感染后，其携带的外源基因需要经过 较长时间才开始表达，这是因为AAV为单链DNA病毒，进入细胞后必须转变成双链才开始 表达，因此不适合用于需要治疗基因快速显效的疾病；②对细胞的感染和转导效率低，通 常比腺病毒低1X1()S 1X10M咅。通常需要按一个细胞至少1乂103 1乂104个AAV病毒颗 粒数计算并使用，而腺病毒则只需按一个细胞10 100个病毒颗粒计算并使用。◎总体上 讲，治疗基因的表达水平较低。因此，实际应用中很难达到预期的治疗效果。如何才能增加rAAV对细胞的感染和转导效率呢？己知rAAV进入细胞首先必须与细胞表面的膜受体结合。已知二类受体与rAAV进入细胞有关， 一类是基础受体，如硫酸肝素蛋 白多糖，另一类是共受体，如整合素a 。 rAAV进入细胞的过程先后由基础受体和共受体介导。因此，细胞表面受体的丰度决定了 rAAV的感染效率。由于细胞膜表面的受体数 量较难改变，故要提高rAAV对细胞的转导效率主要拟从提高rAAV介导的治疗基因表达效 率着手。rAAV是一种单链DNA病毒，根据rAAV的生活周期，当AAV单独感染细胞时，AAV 与受体结合后启动内化，然后脱去衣壳，进而被转移到核内。一部分单链病毒DNA被宿主 细胞识为受损伤的DNA而被降解。另一部分单链病毒DNA通过以自身为模板进行复制形成 双链，或由二条方向不同的单链病毒DNA以碱基配对的方式形成双链。只有双链DNA分子 才能进一步转录表达外源基因。因此，rAAV从单链到双链的转变是限制rAAV表达的一个 瓶颈。当有辅助病毒感染时，AAV将出现产毒性感染，即发生大量病毒DNA复制，并产生新 的病毒颗粒。目前已知的辅助病毒有腺病毒和疱疹病毒。辅助病毒感染可以在AAV感染之 前、同时或之后进行。有研究报道腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1A、 EIB、 E2A 和E4。单疱病毒中的ICPO、 ICP4、螺旋酶、引物酶复合物UL5、 UL8、 UL52、和DNA结合 蛋白UL29参与。因此，在生产AAV及rAAV时必须同时采用腺病毒或单疱病毒联合感染， 或与带有腺病毒E1A、 E1B、 E2A和E4辅助基因的质粒共转染。本领域技术人员认为，由于腺病毒的免疫原性较强，可能影响rAAV携带的外源基因表 达的持续时间。在基因治疗研究和临床试验中通常都是单独使用rAAV,故效果不理想。有文献报道某些因素如紫外线照射、Y射线照射、某些化学致癌剂处理后，在某些类型 的晡乳动物细胞，即使没有辅助病毒存在也可发生AAV产毒性感染。虽然这些情形下，每 个细胞产生AAV病毒的量比有辅助病毒存在时低几个数量级，但这一事实提示还可以采取 除辅助病毒以外的其他方法人为提高AAV的转导效率。不仅增加基因治疗的效果，也提高 了基因治疗的安全性。阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，属于DNA拓扑异构酶抑制物，临床上常用的有阿 霉素、表阿霉素，商品名有多柔吡星、表柔吡星、比柔吡星等，用于治疗恶性肿瘤。阿霉素 又称14-羟基正定霉素，阿得里亚霉素，14-羟基柔红霉素，外文縮写有ADM或DR或DOX 或DXR。化学名为(7S: 9S) -9-羟乙酰基-4-甲氧基-7， 8， 9， 10-四氣-6, 7， 9， 11-四羟 基-7-0-(2，，3，，6，，-三去氧-3，-氯基-a-l-来苏已吡喃基)-5，12-萘二酮。分子式C27H29N011。DXR是从S'treptomycer peucetisu var， caerius的发酵液中提取的一种糖苷抗生素。因其抗瘤谱 广，对乏氧细胞有效，故在肿瘤治疗中占有重要地位。DXR在化学结构、性状、作用机制和 体内过程与柔红霉素(DNR)极为相似，其差别仅在侧链C-14上为羟基(CH20H)，但对 多种动物肿瘤的抑制率均高于DNR，且毒性略低。DXR既含有脂溶性的蒽环配基，又有水 溶性的柔红糖胺，并有酸性酚羟基和碱性氨基，具有很强的抗肿瘤活性。其抗肿瘤作用可归 纳为四个方面 一，与DNA结合，其配基嵌入DNA双螺旋碱基对(主要为G-C碱基对)之 间，嵌入配基的B环和C环与碱基发生作用，这样DNA作为核酸合成模板的功能受损，抑 制DNA聚合酶的活性，阻碍DNA和RNA的合成；二， DXR在酶的作用下还原为半醌自由 基，此自由基的形成与心脏毒性有关；三，与铜、铁形成的螯合物可增强其和DNA的结合; 四，DXR与细胞膜的磷脂结合，破坏膜酶(如腺苷酸环化酶)的活性、细胞膜的结构与功能。 DXR对细胞增殖各期均有杀伤作用，为细胞周期非特异性药物，对S早期及M期最显著， G1期及S晚期则不敏感，并对G1、 G2期有延缓作用。迄今为止，未曾有关于阿霉素提高AAV介导的基因转导效率和表达水平，和尝试在基 因治疗时特别是对变性和遗传性疾病基因治疗时使用阿霉素以提高AAV介导的转导效率和 基因表达水平的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于基因治疗的复合制剂，具体涉及阿霉素类抗肿瘤药物 与腺相关病毒的复合制剂及其用途。本专利技术采用一定浓度的阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒组成复合制剂、以及在眼病、 遗传病及恶性肿瘤基因治疗时联合(同时或先后)使用阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒， 以增强腺相关病毒介导的基因的转导效率和表达水平；本专利技术还公开了系统给予阿霉素或局 部使用阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒、以及复合制剂的基质；阿霉素在提高腺相关病毒 介导的基因转导效率与表达水平、改善腺相关病毒载体基因治疗效果的新的药用本文档来自技高网...

【技术保护点】
阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质：（１）阿霉素类抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素，或称多柔吡星、表柔吡星和比柔吡星；（２）腺相关病毒，包括ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、Ａ ＡＶ５或其他血清型如ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７和／或ＡＡＶ８。

【技术特征摘要】
1、阿霉素类抗肿瘤药物与腺相关病毒的复合制剂，包括活性成分和基质，其特征在于所述的活性成分是以下物质(1)阿霉素类抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素，或称多柔吡星、表柔吡星和比柔吡星；(2)腺相关病毒，包括AAV1、AAV2、AAV5或其他血清型如AAV3、AAV4、AAV6、AAV7和/或AAV8。2、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的腺相关病毒的用量为IX 109 1X10'3AAV病毒颗粒。3、 根据权利要求l所述的复合制剂，其特征是所述的阿霉素的用量为0.001-104、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的复合制剂中的基质是注射 用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或细胞培养基。5、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是所述的制剂是冻干形式或液体形 式。6、 根据权利要求1所述的复合制剂，其特征是其给药方式采用局部注射或静脉 注射方式。7、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式是阿霉素与 腺相关病毒混合后以混合物形式给药，或分别给予阿霉素与腺相关病毒，包括在 局部分别注射阿霉素与腺相关病毒，或同时静脉注射阿霉素与腺相关病毒；或局 部注射腺相关病毒或静脉注射阿霉素。8、 根据权利要求1或6所述的复合制剂，其特征是所述的给药方式其中的给药 的时间顺序是提前注射阿霉素然后再注射腺相关病毒，或同时注射阿霉素与腺相 关病毒，或先注射腺相关病毒后再注射阿霉素。9、 权利要求1所述的复合制剂在制备提高腺相关病毒介导的基因转导效率、表 达水平与持续时间和/或改善腺相关病毒载体基因治疗效果药物中的用途。10、 按权利要求9的用途，其特征是所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄倩，吴继红，张圣海，吴小兵，董小岩，裘玮，刘新建，陈霞芳，谢匡成，李惠明，李川源，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]