夏枯草活性部位，其特征在于所述的活性部位占夏枯草药材的２．７‰ｇ／ｇ，其ＨＰＬＣ指纹图谱有３个共有峰，其保留时间范围为：共有峰１为１５．５６～１５．９１ｍｉｎ，共有峰２为２１．３０～２１．４３ｍｉｎ，共有峰３为３０．９０～３１．４３ｍｉｍ；以迷迭香酸为参照，分析条件为：Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ↓［１８］柱（２００ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相：Ａ：甲醇，Ｂ：乙腈，Ｃ：０．５％醋酸水溶液，线性梯度洗脱，０ｍｉｎ：０．５％Ｂ，９７．５％Ｃ；１０ｍｉｎ：１０％Ｂ，８０％Ｃ；２０ｍｉｎ：２５％Ｂ，７５％Ｃ；３０ｍｉｎ：３０％Ｂ，７０％Ｃ；５０ｍｉｎ：９７．５％Ｂ，２．５％Ｃ；流速：０～２０ｍｉｎ：０．７ｍｌ／ｍｉｎ；３０ｍｉｎ：１ｍｌ／ｍｉｎ；柱温：２５℃；检测波长：２４７ｎｍ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属中医药领域，具体涉及中草药夏枯草活性部位及提取分离技术，和在制备 抗结肠癌的药物组合物中的应用。
技术介绍
夏枯草始载于《神农本草经》，是最常用的中药材之一，现载于2005年版《中国药 典》 一部，为唇形科植物夏枯草(Prunella, vulgarisL.)的干燥果穗，具有清火，明目， 散结，消肿之功效。现代药理学研究发现夏枯草具有降压、降血糖、细胞毒、抗病毒、 抗菌、抗氧化、抗过敏、免疫活性和抗炎活性等多种作用。夏枯草中主要含有三萜类(熊 果酸、齐墩果酸)、甾体类(e-谷甾醇、豆甾醇)、黄酮类(芸香苷、槲皮素)、香豆素 类(伞型酮、莨菪亭)、苯丙素类(咖啡酸、迷迭香酸)、糖类(葡萄糖、果糖)、挥发 油(i， 8-桉油精、e-蒎烯)、无机盐(KC1)等成分。其中夏枯草皂苷具有明显抗艾滋病毒作用；熊果酸及衍生物对细胞P388、 L,2H)和人体肺肿瘤细胞A-549均具有显著的细 胞毒作用；夏枯草总苷与降压作用有关；酚酸类成分具抗炎、镇痛作用，对类风湿性关 节炎具确切的治疗作用，且具有增强免疫抑制作用。从夏枯草中提出的多糖具显著的刺 激免疫作用。夏枯草中的鞣质可能是其抗HlV-lgp41的6-螺旋束构型的主要成分。夏 枯草水提物200mg/ml对HIV-l蛋白酶有显著抑制作用(>90%)，此外水提物还具免疫 调节和抗炎活性。醇提物可对抗肾上腺素升高血糖作用，具有改善糖耐量、增加肝糖元 合成的作用，还具免疫抑制活性。夏枯草有机提取物(OF) (25.7%w/w的迷迭香酸) 有消除DPPH的活性，体外试验有抑制人LDL Cu(II)-mediated氧化，对暴露于的tert-丁基过氧化物或Cu(II)和Fe(III)离子下的大鼠线粒体和肝细胞有保护作用。OF可能 还有抑制溶血和减少通过5-lipoxygenase途径产生的牛PMNL中LTB的生成量。另有试 验证明其有抑制HaCaT细胞和小鼠表皮纤维原细胞增生作用，中剂量的OF可抗革兰氏 阳性菌。临床上以单味夏枯草制得的夏枯草注射液用以治疗肺癌胸水、白血病、中晚期 胃、大肠癌等疗效显著。但迄今未见夏枯草抗结肠癌活性成分研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供中药夏枯草(/vd/a. w/gw!'si:.)的活性部位及其提取方法。 本专利技术的另一目的是将上述活性部位作为药物制剂的原料。 本专利技术还有一个目的是提供上述活性部位在制备防治结肠癌及结肠癌转移药物中 的应用。本专利技术对传统中药夏枯草进行提取分离，获得药效作用明确，具有药用价值的抗结 肠癌活性部位。本专利技术公开的夏枯草活性部位以夏枯草药材为原料，经水提后通过一系列分离纯化技术获得不同的极性部位；然后通过培养人结肠癌细胞，将分离所得的样品在细胞水平上进行生物活性的检测、确定后的具有药理作用的夏枯草有效部位。所述的夏枯草活性部位，占夏枯草药材的2. 7%。 (g/g)。对所述活性部位进行HPLC 指纹图谱分析，条件为Diamonsil C18柱(200mmx4.6mm， 5nm);流动相A:甲醇， B:乙腈，C:0.5。/q醋酸水溶液，线性梯度洗脱，0min:0.5%b，97.5%C; 10min:10%B，80%C; 20min:25%B,75%C; 30min:30%B,70%C; 50min:97.5%B， 2.5%C;流速0 20min: 0.7ml/min; 30min:lml/min;柱温25°C;检测波长247nrn;以迷迭香酸为参照，结果 显示，夏枯草活性部位的HPLC图谱(图4)有3个共有峰，其保留时间范围为共有峰 1约为15.56~15.91min，共有峰2约为2L30 21.43min，共有峰3约为30.90-31.43mim。 各批次药材所得活性部位及所含成分相似度较高，均大于0.9。表1是10批夏枯草活性部位HPLC指纹图谱保留时间(min)。表1共有峰 样l 样2 样3 样4 样5 样6 样7 样8 样9 样IO1 15.564 15.910 15.749 15.750 15.818 15.800 15.821 15.899 15.821 15.8212 21.382 21.429 21.389 21.302 21.403 21.420 21.368 21.399 21.399 21.3313 31.421 31.240 31.288 30.902 31.280 31.332 31.189 31.247 31.343 31.123上述活性部位可作为药物制剂的原料。 本专利技术公开的夏枯草活性部位通过下述方法制备 1、取夏枯草(全草)用水煎煮提取，水提取液过滤，浓縮后加不同浓度的乙醇沉淀， 取上清液浓縮至一定相对密度的清膏，依次加入酸、碱溶液，冷藏，滤过，得夏枯草提取液；或，取夏枯草用水煎煮提取，水提取液经大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱，收集洗脱液， 浓縮至一定相对密度的清膏，得夏枯草提取液；或，取夏枯草用水煎煮提取，水提取液加吸附澄清剂，放置，高速离心，上清液浓縮至 一定相对密度的清膏，依次加入酸、碱溶液，冷藏，抽滤，得夏枯草提取液。所述的夏枯草药材用水煎煮提取时夏枯草与水的重量比为夏枯草水=1: 10 16， 煎煮次数为2 4次；所述的水提取液浓縮至相对密度为1.05~1.09 60~65°C，放至室温，加入75%~95% 乙醇，使含醇量为70%，冷藏48小时以上，回收乙醇至溶液相对密度为1.25-1.28 80 °C，放至室温，再以乙醇调含醇量至85%，冷藏48小时以上，上清液浓縮至1.25~1.28 8(TC的清膏；所述的大孔吸附树脂为非极性树脂，优选HPD100和D101;所述的吸附澄清剂选自甲壳素、壳聚糖、101果汁澄清剂、ZTC1+1中的任一种。 优选壳聚糖以及ZTC1+1系列中的ZTC-II 、 ZTC-III;所述的酸溶液优选浓盐酸调PH为2，碱溶液优选40%氢氧化钠溶液调pH为7-8;冷 藏时间均在24小时以上。2、夏枯草提取液依次以石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，提取液溶剂为 1~3: 1;将分离所得的样品进行细胞水平生物活性的检测，确定水饱和正丁醇提得的部 位为活性部位。上述方法制得的夏枯草活性部位，占夏枯草药材的2. 7%。。取10批夏枯草活性部位 进行HPLC指纹图谱研究，所用HPLC条件为Diamonsil C18柱(200mmx4.6mm， 5pm); 流动相A:甲醇，B:乙腈，C:0.5。/。醋酸水溶液，线性梯度洗脱，0min:0.5%B，97.5%C; 10min:10%B，80%C; 20min:25%B，75%C; 30min:30%B,70%C; 50min:97.5%B,2.5%C; 流速0 20min:0.7ml/min; 30min:lml/min;柱温25°C;检测波长247nm。以迷迭 香酸为参照，HPLC图谱见图1，结果显示各批次药材所得活性部位及所含成分相似度 较高，均大于0.9，说明本专利技术提取分离工艺的稳定可行，为得到稳定可靠的有效成分 提供了保证。本专利技术选择结肠癌细胞株LS174本文档来自技高网...
【技术保护点】
夏枯草活性部位，其特征在于所述的活性部位占夏枯草药材的２．７‰ｇ／ｇ，其ＨＰＬＣ指纹图谱有３个共有峰，其保留时间范围为：共有峰１为１５．５６～１５．９１ｍｉｎ，共有峰２为２１．３０～２１．４３ｍｉｎ，共有峰３为３０．９０～３１．４３ｍｉｍ；以迷迭香酸为参照，分析条件为：Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ↓［１８］柱（２００ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相：Ａ：甲醇，Ｂ：乙腈，Ｃ：０．５％醋酸水溶液，线性梯度洗脱，０ｍｉｎ：０．５％Ｂ，９７．５％Ｃ；１０ｍｉｎ：１０％Ｂ，８０％Ｃ；２０ｍｉｎ：２５％Ｂ，７５％Ｃ；３０ｍｉｎ：３０％Ｂ，７０％Ｃ；５０ｍｉｎ：９７．５％Ｂ，２．５％Ｃ；流速：０～２０ｍｉｎ：０．７ｍｌ／ｍｉｎ；３０ｍｉｎ：１ｍｌ／ｍｉｎ；柱温：２５℃；检测波长：２４７ｎｍ。
【技术特征摘要】
1、夏枯草活性部位，其特征在于所述的活性部位占夏枯草药材的2.7％g/g，其HPLC指纹图谱有3个共有峰，其保留时间范围为共有峰1为15.56~15.91min，共有峰2为21.30~21.43min，共有峰3为30.90~31.43mim；以迷迭香酸为参照，分析条件为Diamonsil C18柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相A甲醇，B乙腈，C0.5％醋酸水溶液，线性梯度洗脱，0min0.5％B，97.5％C；10min10％B，80％C；20min25％B，75％C；30min30％B，70％C；50min97.5％B，2.5％C；流速0～20min0.7ml/min；30min1ml/min；柱温25℃；检测波长247nm。2、 权利要求1的夏枯草活性部位的制备方法，其特征在于通过下述步骤 取夏枯草尸^^// w/g^^L用水煎煮提取，水提取液过滤，浓縮后加不同浓度的乙醇沉淀，取上清液浓縮至8(TC时相对密度为1.25 1.28的清膏，依次加入酸、碱溶液， 冷藏，滤过，得夏枯草提取液；或，取夏枯草用水煎煮提取，水提取液经大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱，收集洗脱 液，回收乙醇后加水稀释，活性炭脱色并浓縮至80。C时相对密度为1.25 1.28的清膏， 得夏枯草提取液；或，取夏枯草用水煎煮提取，水提取液加吸附澄清剂，放置，高速离心，上清液浓缩 至一定相对密度的清膏，依次加入酸、碱溶液，冷藏，抽滤，得夏枯草提取液；上述夏枯草提取液依次以石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，将分离所得的 样品进行细胞生物活性的检测，确定水饱和正丁醇提得的部位为活性部位。3、 根据权利要求2所述的夏枯...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘力，徐德生，周荣耀，钟薏，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属曙光医院，
类型：发明
国别省市：31
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