选择适配体的方法技术

本发明专利技术是用于鉴定针对至少一个靶分子的一个或多个适配体的方法，该方法包括：选择可以与靶分子结合的候选适配体序列，为已结合序列分配每个序列的适配潜力量度（适合性函数），允许一些或全部序列发生进化以产生候选序列的新混合物，并用新产生的候选适配体汇集物重复方法，直至候选汇集物的合计适配潜力到达平台，其中最终汇集物中存在的序列是靶分子的最优适配体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及适配体(aptamer)领域。具体地，本专利技术涉及产生适配体文库和用于 蛋白质组学的蛋白质-特异性适配体的方法，如蛋白质生物标志物鉴定。适配体是短的聚合物，通常为核酸(DNA、RNA、PNA)，其形成明确的三维形状，使它 们可以结合靶分子，其结合方式在概念上与抗体相似。适配体组合了小分子和抗体的最优 性质，包括高特异性和亲和性、化学稳定性、低免疫原性，和靶向蛋白质-蛋白质相互作用 的能力。除了高特异性之外，适配体与它们的靶物之间具有非常高的亲和性。通常，针对蛋 白质产生的适配体在皮摩尔至低纳摩尔范围内有亲和性。与单克隆抗体相反，适配体由化 学合成，而不是生物表达，提供显著的成本优势(8，9)。适配体通常通过称为“通过指数富集的配体系统进化(SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment) ”(SELEX)的体外进化过程产生，所述过程在美国申 请 No. 07/536, 428、美国专利 No. 5，475，096 和美国专利 No. 5，270, 163 中描述。SELEX 过 程包括从候选寡核苷酸的混合物选择，和结合、区分与扩增的逐步迭代(iteration)，使用 同样常用的选择方案进行，以实际上实现任何期望标准的结合亲和性和选择性。从核酸混 合物开始，优选包括随机化序列的区段，SELEX过程包括下述步骤在有利于结合的条件下 用混合物接触靶物，从已经与靶分子特异性结合的那些核酸中区分出未结合核酸，离解核 酸_靶物复合物，扩增从核酸_靶物复合物离解的核酸以获得富含配体的核酸混合物，然后 重复结合、区分、离解和扩增的步骤，按需要进行多次循环，从而获得仅对靶物分子具有最 高结合亲和性的序列。候选寡核苷酸可以包括序列中固定或已知的基序。如果使用完全随 机的序列，候选群体中选择性适配体的发现将完全依赖于机遇。实际上，寡核苷酸序列越随 机，必须依赖于序列对于研究中靶物的选择性的可能性就越大(11，12，13)。对于最基本的形式，SELEX过程可以通过下述系列步骤限定1)制备不同序列的核酸的候选混合物。候选混合物通常包括固定序列的区域 (即，每个候选混合物的成员在相同位置包含相同序列)和随机化序列的区域。选择固定序 列区域以(a)辅助下述扩增步骤，(b)模拟已知可结合靶物的序列，或(c)增加候选混合物 中核酸的指定结构排列的浓度。随机化序列可以是全部随机化的(即，在任何位置找到某 个碱基的可能性是四分之一)或者仅是部分随机化的(例如，可以选择在任何位置找到某 个碱基的可能性为0-100%的任何水平)。2)在有利于于靶物和候选混合物成员之间结合的条件下将候选混合物与选择的 靶物接触。在这种环境中，靶物和候选混合物的核酸之间的相互作用可以认为是在靶物和 对于靶物具有最强亲和性的那些核酸之间形成核酸_靶物对。3)将对于靶物具有最高亲和性的核酸从那些对于靶物具有较低亲和性的核酸中 区分出来。因为在候选混合物中只存在极少量对应于最高亲和性核酸的序列(并且可能只 有一个分子的核酸)，所以通常理想的是设定区分标准，使区分过程中保留候选混合物中大 量的核酸(约5-50% )。4)然后扩增在区分过程中由于对靶物具有相对较高亲和性而选择的那些核酸，以 产生新的候选混合物，其富含对于靶物具有相对较高亲和性的核酸。5)通过重复上面的区分和扩增步骤，新形成的候选混合物包含的弱结合序列越来越少，并且核酸与靶物的平均亲和性程度将逐渐增加。考虑极端情况，SELEX过程将产生包 含一个或少量唯一核酸的候选混合物，所述核酸代表来自对靶物分子具有最高亲和性的原 始候选混合物的那些核酸(11，13)。在产生适配体文库时一个主要的问题是可能的搜索空间的绝对尺度(sheer size)。例如，可以有上百或上千的可能的寡核苷酸序列，其可以对于单个蛋白质具有选择 性和特异性，但是人们从何处开始寻找最佳序列呢？术语“搜索空间”涵盖聚合单元(如核苷酸)能发生在指定长度的适配体分子中所 有可能的或容许的变型。因为在任一次只能研究有限数目的序列，所以候选文库可以仅抽 样指定长度的可能核苷酸序列的可能搜索空间的一部分。例如，有包含四个碱基单位(DNA/ RNA的核苷酸)的IO24个可能的40聚物。因此，来自生物样品的通常蛋白质空间的适配体 搜索空间(对于40聚物核酸)，假定这包含一万个不同的蛋白质，以 102° 1(+/-10倍 因子)的适配体候选聚合物与蛋白质的比例存在。对于60聚物为IO32 1。即使只有IOki 分之一的序列强“适配”，仍然留有针对待研究蛋白质的IO22 1的适配体，以找到一个强适 配序列。然而，对于任何指定的蛋白质，可能有大量的品质各异的适配体。因此SELEX依赖 于合适的序列存在于所研究的初始候选混合物中的机会。然后方法指数性收敛于所选混合 物中可用的最佳解上。在候选文库的设计过程中，可以利用潜在合适序列的一些在先知识， 例如给序列赋予特定的2D或3D结构的序列，以确保过程不完全由机会决定。即便如此， SELEX提供的解极不可能提供问题的最佳解，即针对具体蛋白质的最佳适配体。因此，SELEX过程倾向于使用单个表达和分离的蛋白质靶物，其经得起结合选择， 并且可以通过几轮朝收敛于小适配体集合或单个适配体的扩增而摸索进行。过程通过指数 和迭代选择而从指定序列集合中发现针对分离的蛋白质的“最佳”适配体。在当前已发表 的方案中，使用经常只有lxl(T2°的潜在序列搜索空间(8)，尽管可以理解的是，某些碱基序 列基序作为适配体的可能性远大于其它序列。尽管如此，目前的适配体搜索不可能从汇集 物(pool)中找到全局性最适适配子。而且，搜索的结果非常依赖于初始汇集物的多样性。 在大多数目前的SELEX方案中，适配体必须在候选适配体的初始搜索汇集物中。还极可能 的是，考虑到目前为止进行的小搜索，而在全部适配体空间中，每个蛋白质都可能具有广谱 的可能的适配体。因为SELEX方案是指数性的，并且因为推定的适配体通常必须存在于初 始文库中，所以SELEX难于选择同时针对多个蛋白质靶物的适配体，或者针对掩盖在其它 蛋白质的背景中的一个蛋白质靶物的适配体。SELEX也不能如通常文献中目前所要求的筛 选全部IO15个候选适配体序列。这是因为通常在商品DNA/RNA合成仪上进行的文库合成， 不能将质量控制在验证文库多样性所需的水平。还极可能的是，文库中的一些适配体退火 (粘附)至其它序列上，由于合成过程中的偏差，一些适配体在化学计量上不能充分代表群 体。很多适配体将折叠成三级结构的分布，一些有活性，其它的没有活性。由于其相对稀释 度，很多将简单地永远不会再有机会与靶物蛋白质结合。因此事实上不可能针对蛋白质筛 选IO15个候选的适配体，而且因此搜索甚至比认为的更局限，并且依赖于产生随机序列的 设备的程序编制。已经描述了 SELEX方案上的一些变化，尝试通过向进化适配体中引入随 机变化而避开这些局限(7)。从另一种方式来看，SELEX本质上是计算机演算法的物理体外实施方案。演算法 是一种近似方法，用于帮助解决“足够好”的答案就已足够的问题。在本文这种情况下，问 题是从过大而难于搜索的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定针对至少一个靶分子的一个或多个适配体的方法，所述方法包括：　　ａ）用至少一个靶分子接触候选聚合物序列的汇集物；　　ｂ）从已特异性结合至靶分子的那些序列中区分出未结合序列；　　ｃ）离解序列－靶物复合物，以获得富含配体的序列混合物；ｄ）为步骤ｃ）中获得的每个序列分配该序列的适配体潜力的量度（适合性函数）；　　ｅ）使用步骤ｄ）的量度以确定所述富含配体的混合物的适配潜力；　　ｆ）使用步骤ｅ）中获得的信息，允许步骤ｃ）中获得的一些或全部序列发生进化，以产生序列的新混合物；和ｇ）用新产生的候选适配体汇集物重复步骤ａ）至ｆ），直至候选物汇集物的合计适配潜力达到平台，其中最终汇集物中存在的序列是所述至少一个靶分子的最优适配体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克利夫G布朗，
申请(专利权)人：普罗诺塔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]