衍生自HBS细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞制造技术

本发明专利技术涉及衍生自ＨＢＳ细胞的新型肝细胞样细胞群体以及此类肝细胞样细胞在例如药物治疗、药物筛选和毒性测试中的潜在用途。此外，本发明专利技术涉及可以具有合适的特征的成肝细胞样细胞，从而使得它们可以用于与肝细胞样细胞相同的应用，且进一步可以用于肝发生例如早期肝发生或肝再生病症的体外研究。根据本发明专利技术的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞在基因或蛋白质表达水平上表达药物转运蛋白和／或药物代谢特征。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景本专利技术涉及衍生自hBS细胞的新型肝细胞样细胞群体以及此类肝细胞样细胞在例如药物治疗、药物筛选和毒性测试中的潜在用途。此外，本专利技术涉及可以具有合适的特征的成肝细胞样细胞，从而使得它们可以用于进行扩增且在需要时进一步分化成功能肝细胞样细胞，且进一步可以用于肝发生的体外和体内研究，例如早期肝发生或肝再生病症。根据本专利技术的肝细胞样细胞在基因或蛋白质表达水平上表达药物转运蛋白和/或药物代谢特征。专利技术背景期望多能性人干细胞彻底变革对于各种人细胞类型的可及性。繁殖多能性人胚泡衍生干(hBS)细胞且随后使其进一步分化成所需靶细胞类型的可能性，将为在体内和体外的一系列应用提供稳定和基本上无限的细胞供应。肝衰竭和晚期肝病造成全世界的大量死亡，并且是卫生保健系统的主要负荷。肝移植仍是最成功的治疗。然而，这种操作的功效是有限的且与许多并发症例(如感染或排斥)相联系。肝移植还面临可用的供体器官的短缺并且被治疗的患者很经常将涉及终生的免疫抑制。通过减少关于器官的需要，基于细胞的治疗对于患有这些严重疾病的社会和个体将具有极大的重要性。此外，肝脏是人体中的代谢和解毒中心，且因此已付出大量努力以便鉴定可靠来源的功能性细胞类型用于体外测试。不幸的是，肝脏的复杂性和功能不能由目前可用的任何细胞类型反映。原代人肝细胞的可用性是有限的，并且当用于体外应用时，还已知所述细胞快速丧失其正常表型和功能性质(即在24小时内)。关于原代细胞的一种常用备选物是反之包含极低水平的代谢酶，且具有基本上不同于体内天-->然肝细胞的其他重要蛋白质分布的肝细胞系。因此，许多测试仍使用动物材料来进行，尽管已知肝代谢是物种特异性的，且由此产生在预测与测试的物种不同的另一个物种中的肝毒性的困难。在药物开发中，有害肝脏反应仍是最显著的毒性倾向。因此，当选择化合物以进入临床试验时，人肝脏毒性倾向的早期预测具有首要的重要性。改善这个领域中的性能的努力必须解决可用性问题和模型的开发，这提供了对复杂的生物过程的更高的涉及范围，所述生物过程与在人中诱导不利的肝损伤一致。在2个领域中，衍生自hBS细胞的分化细胞的使用提供有希望的机会。因此，迫切需要模拟人肝细胞且能够预测新药物或化学制品的开发中的候选分子效果的模型系统。就可用性和生理学相关性而言，人多能干细胞可以充当功能性人肝细胞的理想的可更新来源。当将hBS细胞置于合适的环境中时，在分化2-4周后观察到某些肝特征。由Rambhatla等人2003，WO 01/81549和WO 2005/097980的先前研究已鉴定具有某些肝细胞样特征的细胞，即分化的hBS细胞培养中的CYP和GST活性，但就药物转运蛋白表达以及特异性CYP和GST表达模式而言，迄今为止所产生的细胞未显示出可能替代传统肝脏系统所需的代谢性质。在本专利技术中呈现了用于药物开发和再生医学的hBS细胞衍生的肝细胞样细胞群体，其具有重要的代谢酶以及药物转运蛋白至少72小时的稳定表达。Cellartis专利申请WO2006034873基于允许以限定方式使用不同因子以跟踪发育生物学的途径的方法。在本专利技术中，这主要是影响分化的细胞的分泌型内在因子。此外，培养基的替换频率不同。本方法允许较不频繁的替换培养基且因此是较不费力的方法。此外，本专利技术的细胞是更成熟的且可以在用于药物开发和毒性测试的测定系统中培养更长时间段。WO2005097980和US20030003573都没有教导关于药物转运蛋白或功能转运蛋白的存在。WO2005097980仅阐述CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2是用于药物筛选的所需酶(参见表3)。然而，该申请未教导关于这-->些最重要的CYPs的活性的任何事情。特别地，CYP3A4是用于在药物开发和毒性测试中使用的单个最重要的酶。所有药物中的大多数经由CYP3A4进行代谢。因此，希望衍生自hBS细胞的肝细胞在反映人成年肝细胞的不同个体间组成中显示出功能性CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2酶，那么这是希望的。对于药物开发和毒性测试也希望衍生自hBS的肝细胞具有(i)功能性CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2酶，(ii)功能性GST酶和(ii)功能性药物转运蛋白的组合。就最重要的CYPs和药物转运蛋白而言，WO200509780中没有详细描述所述细胞，并且此外，它显示有限的GSTs表征数据。相反，本专利技术具有II期酶的充分描述。专利技术简述本专利技术涉及肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞，以及用于其分别的制备的方法。本专利技术的肝细胞样细胞特别良好地适合用于在药物开发和毒性测试中使用，因为它们表达药物转运蛋白和/或代谢酶。人胚泡衍生干细胞(hBS细胞)是多能的且可以产生所有3个胚胎胚层的细胞：内胚层、外胚层和中胚层，且进一步产生所有体细胞和生殖细胞。因此，在未来，具有肝细胞的功能特征的衍生自hBS细胞的分化细胞不仅具有用于移植或在生物反应器中用于在具有肝衰竭的患者中额外的体肝支持的潜能，还作为测试系统用于研究药物靶、异生物质的肝代谢和肝毒性。需要时，hBS衍生的肝细胞可以潜在提供来自同一基因供体的功能性人肝细胞的无限来源，并且因此改善体外测试(例如毒性测试)的预测性且减少动物实验的需要。然而，异生物质的毒性通常依赖其生物转化成毒性和反应性代谢物，且因此需要生物转化系统的存在和分布。目前，原代人肝细胞构成用于体外药物代谢和毒性测试的模型。然而，当培养原代肝细胞时，药物代谢酶的活性和许多转运蛋白功能快速丧失和/或改变。此外，用于体外研究的许多肝瘤细胞系(例如HepG2)缺乏许多重要的药物代谢酶的表达。细胞色素P450s(CYP)是混合的功能单加氧酶和异生物质的I期代谢中的主要酶。取决于异生物质的性质，这种氧化代谢导致药物前-->体的灭活和促进的消除、激活或代谢激活。CYP表达的主要位点是肝脏，并且CYP3A4是人成年肝脏中最丰富的CYP同工酶。对于药物代谢最重要的酶属于家族1-3，负责临床使用药物的所有I期依赖性代谢的70-80％。由于多态性，CYP表达和活性呈现大的个体间差异。此外，CYP可以由特异性药物诱导几倍或抑制，导致另外的，尽管是暂时的，代谢活性的可变性。值得注意的是，肝细胞内的3个主要CYP-家族(1-3)基本CYP活性的组成对于药物代谢具有极大的重要性。在本文的实施例中描述了hBS细胞衍生的肝细胞样细胞，其中检测到来自大多数本文档来自技高网...

【技术保护点】
衍生自ｈＢＳ细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少２０％的所述细胞显示出至少一个下述特征：α－１－抗胰蛋白酶、细胞角蛋白１８、ＨＮＦ－３β、白蛋白或肝－脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述６个特征中的至少３个　Ａ．药物转运蛋白　 　ｉ）至少１％的所述细胞显示出ＢＳＥＰ的蛋白质和／或基因表达，　ｉｉ）至少１％的所述细胞显示出ＭＲＰ２的蛋白质和／或基因表达，　ｉｉｉ）至少１％的所述细胞显示出ＯＡＴＰ－２和／或ＯＡＴＰ－８的蛋白质和／或基因表达，　Ｂ． 药物代谢酶　ｉｖ）至少２０％的所述细胞显示出ＧＳＴ　Ａ１－１的蛋白质和／或基因表达，　ｖ）至少２０％的所述细胞显示出ＣＹＰ４５０ｓ－１Ａ２、－２Ａ６、－２Ｂ６、－２Ｃ８、－２Ｃ９、－２Ｃ１９－２Ｄ６、－２Ｅ１、－３Ａ４和－３Ａ７ 中至少２种的蛋白质和／或基因表达，　ｖｉ）至少２０％的所述细胞未显示出ＧＳＴ　Ｐ１－１的蛋白质和／或基因表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】SE 2006-6-4 0601255-3;US 2006-6-5 60/810,626;DK 201.衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少20％
的所述细胞显示出至少一个下述特征：α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白
18、HNF-3β、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有
下述6个特征中的至少3个
A.药物转运蛋白
i)至少1％的所述细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，
ii)至少1％的所述细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，
iii)至少1％的所述细胞显示出OATP-2和/或OATP-8的蛋白质
和/或基因表达，
B.药物代谢酶
iv)至少20％的所述细胞显示出GST A1-1的蛋白质和/或基因表
达，
v)至少20％的所述细胞显示出CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、
-2C9、-2C19-2D6、-2E1、-3A4和-3A7中至少2种的蛋白质和/或基
因表达，
vi)至少20％的所述细胞未显示出GST P1-1的蛋白质和/或基因
表达。
2.根据权利要求1的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少一个
所述药物转运蛋白特征和至少一个所述药物代谢特征。
3.根据权利要求1或2中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
具有至少4个，例如至少5个所述特征。
4.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体具
有全部6个所述特征。
5.根据权利要求1或2的细胞群体，其中所述细胞群体中至少
20％的所述细胞显示出至少一个下述特征：α-1-抗胰蛋白酶、细胞角
蛋白18、HNF-3β、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体
具有下述特征
A.药物转运蛋白
iii)至少1％的所述细胞显示出功能活性的OATP-2和/或OATP-8，
B.药物代谢酶
iv)至少20％的所述细胞显示出GSTA1-1的功能活性，
v)至少20％的所述细胞显示出通过分析所述药物代谢产物测量
的功能活性的Cyp1A2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。
6.根据权利要求1或2的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少
75％的所述细胞显示出下述特征：α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、
HNF-3β、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述
特征
A.药物转运蛋白
iii)至少10％的所述细胞显示出功能活性的OATP-2和/或
OATP-8，
B.药物代谢酶
iv)至少30％的所述细胞显示出GSTA1-1的功能活性，
v)至少50％的所述细胞显示出通过分析所述药物代谢产物测量
的功能活性的Cyp1A2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。
7.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征i)对于至
少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40
％或至少50％的所述细胞有效。
8.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征ii)对于
至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％或至少80％的所述细胞有效。
9.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征iii)对于
至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％或至少80％的所述细胞有效。
10.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征iv)对于
至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少
80％的所述细胞有效。
11.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征v)对于
至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少
80％的所述细胞有效。
12.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征vi)对于
至少10％，例如至少20％、至少30％，例如至少40％、至少50％、
至少60％、至少70％或至少80％的所述细胞有效。
13.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
中至少约30％，例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少
约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的所述细胞表达至
少一个下述特征：α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3β、白蛋
白或肝-脂肪酸结合蛋白。
14.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP1A2。
15.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2A6。
16.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2B6。
17.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2C8、CYP2C9和/或CYP2C19。
18.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2D6。
19.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2E1。
20.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP3A4和/或CYP3A7。
21.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5％的
所述细胞具有至少一个下述附加特征
A.受体
vii)至少5％的所述细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，
B.细胞间粘附分子
viii)至少5％的所述细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或基因表
达，
C.药物代谢酶
ix)至少1％的所述细胞显示出UGT的蛋白质和/或基因表达，
D：转录因子
x)至少90％的所述细胞未显示出Oct-4的蛋白质和/或基因表达。
22.根据权利要求21的细胞群体，其中所述细胞群体具有特征
vii)、viii)、ix)或x)中的至少2个，例如至少3个。
23.根据权利要求21或22的细胞群体，其中所述细胞群体具有
特征vii)、viii)、ix)或x)中的全部4个。
24.根据权利要求21-23中任一项的细胞群体，其中特征vii)
对于至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、
至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述细胞有效。
25.根据权利要求21-24中任一项的细胞群体，其中特征viii)
对于至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、
至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述细胞有效。
26.根据权利要求21-25中任一项的细胞群体，其中特征i x)对
于至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至
少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所述细胞有
效。
27.根据权利要求21-26中任一项的细胞群体，其中特征x)对
于至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至
少60％、至少70％、至少80％、至少95％的所述细胞有效。
28.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少一种所述
CYP450蛋白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。
29.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述GST A1-1
和/或GST M1-1蛋白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。
30.根据权利要求21-29中任一项的细胞群体，其中所述UGT蛋
白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。
31.根据权利要求28-30中任一项的细胞群体，其中所述诱导物
选自单独或组合的地塞米松、奥美拉唑。
32.根据权利要求28-31中任一项的细胞群体，其中所述诱导物
包括利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼。
33.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
显示出特征v)的至少一种所述CYP450蛋白质的酶促活性。
34.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
显示出GST酶促活性。
35.根据权利要求33的细胞群体，其中所述GST酶促活性是所述
细胞群体的裂解物中的至少0.4μmol/分钟/mg，例如至少0.03μ
mol/分钟/mg、至少0.05μmol/分钟/mg、至少1.0μmol/分钟/mg、
至少0.07μmol/分钟/mg、至少0.09μmol/分钟/mg、至少0.11μ
mol/分钟/mg、至少0.13μmol/分钟/mg或至少0.15μmol/分钟/mg
蛋白质。
36.根据权利要求21-35中任一项的细胞群体，其中所述细胞群
体显示出UGT酶促活性。
37.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
在体外培养至少1个月，仍保持特征。
38.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
在体外培养至少1周，仍保持特征。
39.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
在体外培养至少72小时，仍保持特征。
40.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
进一步表达甲胎蛋白。
41.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
在饲养细胞例如人或小鼠饲养细胞的存在下获得。
42.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体
在不存在饲养细胞的情况下获得。
43.根据权利要求42的细胞群体，其中所述细胞群体使用细胞外
基质获得，其中所述基质具有限定或未限定组成。
44.根据权利要求42或43中任一项的细胞群体，其中所述细胞
群体使用塑料细胞培养瓶获得，所述塑料细胞培养瓶在内部上用单独
或组合的一种或多种蛋白质进行包被。
45.根据权利要求44的细胞群体，其中所述一种或多种蛋白质选
自胶原、层粘连蛋白及其组合。
46.根据权利要求44或45中任一项的细胞群体，其中所述细胞
群体使用3D环境例如多孔滤器获得。
47.根据权利要求41-46中任一项的细胞群体，其中所述细胞群
体不含异物。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：N海因斯，B屈佩尔斯芒瑟，J埃德斯巴戈，
申请(专利权)人：塞拉提斯股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]