通过使用闭合吸管玻璃化方法低温贮藏人胚泡来源的干细胞技术

用于生物学细胞，特别是胚泡来源的干细胞（ＢＳ细胞）玻璃化的改进方法。所述方法对在解冻后保持生活力的细胞非常温和。所述方法包括，ｉ）将细胞转移至第一种溶液（溶液Ａ）中，ｉｉ）任选地在第一种溶液中温育所述细胞，ｉｉｉ）将步骤ｉ）或ｉｉ）中获得的细胞转移至第二种溶液（溶液Ｂ）中，ｉｖ）任选地在第二种溶液中温育所述细胞，ｖ）将从步骤ｉｉｉ）或ｉｖ）中获得的细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少２０μｌ体积大小的闭合吸管，ｖｉ）封闭所述一个或多个闭合吸管，和ｖｉｉ）玻璃化一个或多个闭合吸管。本发明专利技术的重要特征在使用闭合吸管以及可被有效地玻璃化和随后被解冻的相对较大的体积。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于玻璃化生物学细胞，特别是胚泡来源的干细胞 (BS细胞)的改进方法。所述方法对解冻后仍保持活性的细胞是非常 温和的。
技术介绍
干细胞是具有自我更新和产生特化或分化细胞之独特能力的细 胞类型。尽管绝大部分体细胞，例如心脏细胞或皮肤细胞，负责行使 特定功能，但干细胞在其接收到发育成特定细胞类型的信号之前功能 未定。形成所述干细胞独特性的是其增殖能力以及其发生分化的能力。 多年来，研究人员致力于寻找使用干细胞替代受损或病变的细胞和組 织的方法。目前，大部分研究集中于两种类型的干细胞，胚胎干细胞 和体细胞干细胞。胚胎干细胞来源于胚胎植入前的受精卵母细胞，即 胚泡，而所述体细胞干细胞存在于成熟生物体中，例如骨髓、表皮和 肠内。根据许多欧洲和其它国家的国家法律，受精卵在植入子宫前即 受精后10-14天并不被认为是胚胎，因此当如本专利技术应用时，这类细 胞在此处被称为胚泡来源的干细胞或hBS细胞。多能性检验已显示尽 管所述胚胎或胚泡来源的干细胞可产生生物体内的所有细胞，包括生 殖细胞，但体细胞千细胞具有更有限的衍生细胞类型集库。1998年，研究人员第一次能从人受精卵母细胞中分离出胚胎干细 胞并将其培养在培养基中，参见例如美国专利5 843 780和美国专利66200 806。在干细胞
中越来越多的研究和进展需要获得适合于保存所述细胞和细胞系的方法。细胞可通过玻璃化或冷冻贮藏。由于细胞外冰的形成具有破坏作用，因此使用常规方法的低温贮藏很难应用于复杂和敏感的生物学材料。经过玻璃化过程，含有所述细胞的样品被快速冷却至极低的温度，水容物不结晶而形成的玻璃样态。因此，玻璃化是在无冰晶形成的情况下快速冷冻液体介质的方法。无定形玻璃在直接将例如含有细胞的吸管放入液氮中的快速冷冻过程中形成。所述玻璃保持液体的正常分布但以过冷却的形式保存。所述玻璃避免了水晶并且所述细胞免受与冰晶形成相关的细胞损害。因此，将玻璃化定义为避免晶核形成和生长的无定形玻璃样态的固化。曾经对人胚胎干细胞低温贮藏进行研究并且Reubinoff等人(Human Reproduction, 2001,16， 2187-2194)描述了通过使用开口抽拉式吸管玻璃化方法进行低温贮藏这些细胞的方法。所述方法的缺点是其涉及到吸管的开口端与液氮接触，这可能会成为将要被玻璃化的生物材料的污染源。此外，由于抽拉吸管的大小，Reubinoff等人进行玻璃化的体积约为ljd。用于避免与氮直接接触的玻璃化方法已在Lopez-Bejar等人(Theriogenology， 2002，58:1541-52)对兔胚胎和Chen等人(HumanReproduction, 2001,16 (11): 2350-56)对小鼠卵母细胞的应用中得以描述。这些方法都使用了与已知的开口抽拉吸管相同的抽拉方式并因此而拥有与Reubinoff等人使用的抽拉吸管具有相同大小的封闭抽拉吸管。因此，在这些方法中，各吸管中玻璃化的体积约都为1-2^1。慢速冷冻和快速解冻方法曾用来低温贮藏细胞系。尽管这些方法适合用来低温贮藏例如小鼠胚胎干细胞，但对于未分化的人胚胎干细胞的存活率似乎很低，而且绝大部分所述细胞分化或死亡。通常，用这种慢速冷冻方法玻璃化较大体积的细胞会导致较低的恢复率(Reubinoff等人)。因此，仍就需要发展易于操作、涉及尽可能少的步骤而同时在所7化方法。特别地，需要发展用于细胞或细胞系(例如hBS或hBS细胞系)的较大体积玻璃化的有效方法。专利技术描述如上所述，有效的低温贮藏方法是胚泡来源的干细胞系产生和广泛应用、并在此之下建立人胚泡干细胞库所必须的。有效的冷冻和解冻技术能够有效地保存细胞和细胞系。为了一些目的，希望在每一根吸管中进行大体积玻璃化。例如当在给定的步骤(或应用)中需要大量况。本专利技术涉及用于细胞玻璃化的方法，包括i) 将细胞转移至第 一种溶液(溶液A)中，ii) 任选地在第一种溶液中温育所述细胞，iii) 将步骤i)或ii)中获得的细胞转移至第二种溶液(溶液B)中，iv) 任选地在第二种溶液中温育所述细胞，v) 将从步骤iii)或iv)中获得的细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少20jil体积大小的闭合吸管，vi) 封闭所述一个或多个闭合吸管，和vii) 玻璃化一个或多个闭合吸管。上述方法的一个非常重要的特征是每一吸管中可被玻璃化的大体积。本专利技术涉及用于玻璃化闭合吸管中的细胞的方法，所述闭合吸管具有允许在其中容纳从约20^1至约250^1，例如从约20^1至约225^1，从约25jil至约200^1，从约25nl至约175fil，从约25pl至约150ji1，从约30^1至约125^1，从约30^1至约100^1，从约35jil至约75^1，从约40^1至约50nl体积的大小。在本专利技术提供的实施例中使用的吸管长度约为13cm，直径约为2mm和约为O.lmm厚的非常薄的塑料管壁(闭合吸管，French迷你吸管，250^1， L，Aigle， IMV ZA 475。， 133mm，Svensk Mj61k)。然而，可以想象假设装液氮的容器的大小允许液氮淹没整个吸管的长度，只要吸管的直径和厚度几乎与此处所使用的吸管一样，那么使用更长的吸管就可成功地玻璃化甚至更大的体积。另一个上述方法中非常重要的步骤是使用所谓的闭合吸管。在本上下文中，术语闭合吸管用来指在装填位置具有能使例如在合适培养基中的生物学物质(例如细胞或细胞系)装入的开口端的吸管，但在装入后立即紧密封闭该末端以避免来自周围不想要的细胞污染并且也避免不想要的来自细胞的周边污染的风险。吸管两端的气密性封闭对防止样品和环境的污染非常重要。来自Cryo Bio System称为CBSSYMS的手工封闭单元是一种合适的系统。在所述吸管的一边开口而在另一边装有塞子是非常重要的。该塞子允许用注射器吸入空气以使吸管充入液体，但一旦其与液体直接接触则聚合化，在该端封闭毛细管。也可以使用封闭该端的其它合适方法。然后使用密封物(焊接、粘合等)封闭另一端。重要的是壁要薄并且直径要小，以使吸管中的内含物快速冷却。吸管长度并不是太关键，但为实际需要，其长度最好是标准长度，以适合液氮灌中的标准支架。所述吸管由塑料制得，但也可由任何合适的材料包括玻璃(尽管其可能更容易断裂)制得。重要的是所述材料要安全并且不吸收或释放物质，其是无孔、无毒和生物相容性的。在本专利技术应用中，术语低温贮藏，，是指在极端低的温度下保存生物学材料。在本专利技术上下文中所使用的术语直接接触，，或直接暴露于，，是指如果生物学材料或所述材料所存在的培养基、溶液或材料的表面与冷冻材料接触时，称生物学材料直接接触或直接暴露于例如冷冻材料。本专利技术上下文中所使用的术语冷冻材料，是指任何能够造成生物学材料玻璃化的材料。因为样品不直接与冷冻材料接触，理论上可使用任何足够冷的冷冻介质。合适的材料包括但不限于液态气体例如液氮、液态丙烷、液氦、乙烷等。此处所使用的生活力是指在一段时间内生物学材料能够正常生9存、发育和增殖。根据本专利技术，将至少20fil体积的生物学材料(例如hBS细胞或hBS细胞系)置于闭合吸管中。然后将所述闭合吸管暴露于冷冻材料(合适地液氮)中。 一旦暴露于冷冻材料，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于细胞玻璃化的方法，包括　ｉ）将细胞转移至第一种溶液（溶液Ａ）中，　ｉｉ）任选地在第一种溶液中温育所述细胞，　ｉｉｉ）将步骤ｉ）或ｉｉ）中获得的所述细胞转移至第二种溶液（溶液Ｂ）中，　ｉｖ）任选地在第二种溶液中温育 所述细胞，　ｖ）将从步骤ｉｉｉ）或ｉｖ）中获得的所述细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少２０μｌ体积大小的闭合吸管，　ｖｉ）封闭所述一个或多个闭合吸管，和　ｖｉｉ）玻璃化一个或多个闭合吸管。

【技术特征摘要】
US 2003-5-8 60/469,320;DK 2003-5-8 PA200300700;DK 1. 用于细胞玻璃化的方法，包括i)将细胞转移至第一种溶液(溶液A)中，ii)任选地在第一种溶液中温育所述细胞，iii)将步骤i)或ii)中获得的所述细胞转移至第二种溶液(溶液B)中，iv)任选地在第二种溶液中温育所述细胞，v)将从步骤iii)或iv)中获得的所述细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少20μl体积大小的闭合吸管，vi)封闭所述一个或多个闭合吸管，和vii)玻璃化一个或多个闭合吸管。2. 权利要求l的方法，其中所述闭合吸管的大小允许具有的体积 从约20^1至约250nl，例如从约20|nl至约225nl、从约25pl至约200nl、 从约25|xl至约175fd、从约25pl至约150fil、从约30fil至约125^1、从 约30^1至约100nl、从约35^1至约75pl、从约40^1至约50nl。3. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是BS细胞或BS 细胞系。4. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是hBS细胞或 hBS细胞系。5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液中 至少 一种包含一种或多种冷冻保护剂。6. 权利要求5的方法，其中一种或多种冷冻保护剂选自甘油、海 藻糖、蔗糖、1， 2-亚乙基二醇、DMSO、丙二醇和/或其混合物。7. 权利要求5或6中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液 包含一种或多种相同或不同的冷冻保护剂。8. 权利要求5-7中任一项的方法，其中在所述第一和第二种溶液 中的一种或多种冷冻保护剂的浓度相同或不同。9. 权利要求5-8中任一项的方法，其中在所述第二种溶液中冷冻 保护剂的总浓度(按。/dv/v、 ％w/v或M计算)大于在所述第一种溶液中的浓度。10. 权利要求5-9中任一项的方法，其中所述冷冻保护剂是海藻糖。11. 权利要求10的方法，其中所述海藻糖的浓度从约0.02M至约 1M，例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M，从约0.2M至 约0.7M，从约0.3M至约0.65M,从约0.4M至约0.6M，从约0.45M至 约0.55M。12. 权利要求5-9中任一项的方法，其中所述冷冻保护剂是蔗糖。13. 权利要求12的方法，其中所述蔗糖的浓度在从约0.02M至约 1M，例如从约0.05M至约0.9M,从约0.1M至约0.8M,从约0.2M至 约0.7M，从约0.3M至约0.65M，从约0.4M至约0.6M,从约0.45M至 约0.55M。14. 前述权利要求中任一项的方法，其中在所述第一和第二种溶液 中至少 一种包含粘度调节剂。15. 权利要求14的方法，其中所述粘度调节剂选自菲可、珀可、 透明质酸、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、明胶和甘油。16. 权利要求14或15的方法，其中所述粘度调节剂是菲可。17. 权利要求16的方法，其中菲可的浓度至多是约150mg/ml，例 如至多约为100mg/ml，至多约为50mg/ml，至多约为25mg/ml，至多 约为15mg/ml或至多约为10mg/ml。18. 权利要求14-17中任一项的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：A舍格伦，E舍格伦詹森，S埃内巴克，P埃里克森，
申请(专利权)人：塞拉提斯股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]